Micropatterning היא טכניקה רבת עוצמה בשימוש על ידי מדענים כדי להבין קשרים בין צורת התא לבין הפעילות של מכונות בין תאיות. למרות מספר טכניקות לאפשר לחוקרים לווסת את צורת התא, טכניקות אלה לעתים קרובות דורשים ציוד מיוחד נגיש כמה מעבדות ביולוגיה. וידאו זה ידריך אותך לאורך השלבים הדרושים כדי להפוך micropatterning על מערכת הדמיה מולטי פוטון זמין מסחרית.
אחד היתרונות של פרוטוקול זה הוא שהוא נמנע משימוש בציוד מיוחד. דפוסים ניתן גם לשנות בקלות ללא refabricating photomasks, שהוא בדרך כלל התהליך גוזל זמן רב ביותר micropatterning. כלי עיבוד התמונה שלנו יוצר תמונות תא ממוצעות המשקפות התפלגות מייצגת של חלבונים באופן לא משוחד ואוטומטי.
למרות שאנו משתמשים בכיסויים בניסויים שלנו, זרימת העבודה האוטומטית גם מאפשרת לך לדפוס על שקופיות ומנות תחתית זכוכית. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון שהגדרת מיקרוסקופ נכונה היא קריטית עבור המערכת כדי לדמות, לזהות את מישור המוקד הנכון, ואת התבנית באופן אוטומטי. הכן פתרון PVA כפי שהונחה.
הוסף חלק אחד של HCL לשמונה חלקים PVA. הפוך את הצינור בזהירות כמה פעמים כדי לערבב. יוצקים שני מיליליטרים של הפתרון לתוך צלחת פטרי קטנה לטבול כיסוי מעובד מראש נקי לתוך הנוזל.
דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות על שייקר. הסר בזהירות את ה- coverslip מהפתרון. השתמש ספינר coverslip לסובב את המעיל במשך 40 שניות.
בינתיים, תנקה את פינצטה. מעבירים את הכיסוי לקופסה ומתייבשים בארבע מעלות למשך הלילה. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ.
ראשית, הגדר את קו הלייזר ל-750 ננומטר. לאחר מכן הגדר תצורה אופטית חדשה בשם , תמונה. זוהי התצורה האופטית הבסיסית המאפשרת לנו לדמיין את הכיסוי באמצעות מחזירי אור.
השאר אפשרויות אחרות כברירת מחדל ובחר את המטרה המתאימה. קבע את תצורת הגדרות החומרה תחת תצורה אופטית זו. הגדר את לייזר אינפרא אדום כלייזר הגירוי שלנו.
מקם את מפצל הקרן בנתיב האור כדי להשתמש בלייזר IR להדמיה. בחר את יחידת הסורק של גלוונו ואת גלאי הסריקה D המתאים. בחר גודל סריקה וזמן השתהות שמספיק כדי ללכוד תכונות קטנות ב- coverslip.
ודא שהתיבה השתמש בלייזר IR מסומנת. כוונן את עוצמת הלייזר של הרכישה ואת רגישות הגלאי כדי לקבל תמונה בהירה, אך לא רוויה, של משטח ה-coverslip. בחלון אזור הסריקה, הגדר מרחק מתצוגה לאחד כדי ללכוד את כל שדה התצוגה.
שמור את התצורה האופטית. עכשיו נארגן סדרה של תצורות אופטיות שיאפשרו למיקרוסקופ להתמקד, לטעון את מסכת ההחזר על ההשקעה וליצור דפוסים באופן אוטומטי. התצורה האופטית הראשונה מאפשרת לנו להדפיס סמן נאמנות המשמש להתמקדות אוטומטית בשדה הראייה הנוכחי.
שכפל את התצורה האופטית של התמונה ושנה את שמה, הדפס סמן נאמנות. מכיוון שאנו מדפיסים בשלב זה, הזז את מפצל הקרן מנתיב האור והחלף אותו במראה דיכרית מתאימה. בחר את גודל הסריקה הקטן ביותר כדי לחסוך זמן.
מכיוון שלא נדרשת הדמיה בשלב זה, הגדר את רגישות הגלאי לאפס. הגבר את עוצמת הלייזר כדי לאפשר הדפסה. בחלון אזור הסריקה, הגדר את גודל התצוגה למקסימום והצב את אזור הסריקה במרכז שדה התצוגה.
עכשיו אנחנו נארגן ניסוי מחסנית Z כדי להסביר כל אי אחידות במשטח PVA. הגדר את התנועה במיקום Z ליחסית. בחר את התקן Z המתאים.
לאחר מכן, שכפל את התצורה האופטית של התמונה ושנה את שמה, מוקד אוטומטי. בחר את גודל הסריקה הקטן ביותר והקטן את מקדם גודל התצוגה בחלון אזור הסריקה כך שדה התצוגה יהיה מעט גדול יותר מסמן הנאמנות. פעולה זו מבטיחה שתכונות קטנות אחרות ב- coverslip לא יפריעו להתמקדות אוטומטית.
בתפריט התקנים, בחר הגדרת מיקוד אוטומטי. הגדר את עובי הסריקה לזה בניסוי מחסנית Z. המיקרוסקופ יסרוק את הטווח הזה וימצא את מישור המוקד הטוב ביותר באמצעות סמן הנאמנות.
לאחר מכן, שכפל את התצורה האופטית של התמונה ושנה את שמה, טען החזר על ההשקעה. הגדר את גודל הסריקה זהה לגודל מסיכת ההחזרה על ההשקעה מכיוון שהמסיכה תיטען על תמונה שצולמה בתצורה אופטית זו. השתמשנו בפיקסלים 2048 כדי להשיג איזון אופטימלי בין רזולוציה למהירות.
עכשיו אנחנו נגדיר את התצורה האופטית המשמשת לתבנית הכיסוי. שכפל את התצורה האופטית של סמן הנאמנות המודפס ושנה את שמו, Micropattern. הגדר את פקטור גודל התצוגה לאחת.
הגדל את כוח לייזר גירוי כדי ablate PVA. בחר מהירות סריקה מתאימה. בחלון גירוי ND, להגדיר ניסוי גירוי ND.
הוסף כמה שלבים ללוח הזמנים וקבע כל אחד בגירוי. ודא שאזור הגירוי ומשך הזמן נכונים. באותו חלון, הפעל את פונקציית הזזת השלב הראשי Z לפני כל שלב.
זה שוב מסביר את כל הסטיות בכיוון Z. לבסוף, הגדר תצורה אופטית כדי ליצור תווית גלויה על ה-coverslip שיכולה לעזור לנו לאתר את התבניות. שכפל את סמן הנאמנות של ההדפסה ושנה את שמו, משטח תווית.
הגדל את עוצמת הלייזר באופן משמעותי והגדר זום לאחד. מעבירים את הכיסוי מצופה PVA למחזיק. למיקרוסקופ זקוף, ודאו שפני השטח של PVA פונים כלפי מטה.
מוסיפים מים לפינות כדי לייצב את הכיסוי. הר המחזיק על במת המיקרוסקופ. מנמיכים את המטרה ומוסיפים מים ביניהם.
בתוכנת המיקרוסקופ, הפעל את תריס הלייזר של IR ובצע יישור אוטומטי לפני הדפוס. עבור לתצורה האופטית של התמונה. סרוק את שדה הראייה תוך הקרבה איטית של המטרה לכיסוי.
בהתחלה, התמונה תיראה עמומה מאוד. קירבו את המטרה לכיסוי עד שהבהירות של התמונה תגדל מעט. זהו משטח הכיסוי הפונה למטרה.
המשך להזיז את המטרה עד שהבהירות תפחת ותעלה שוב. זה משטח PVA שאנחנו דפוס. התמקד בכל תכונה קטנה, כגון פגמים או אבק, והגדר אפס בכונן Z.
עבור לתצורה האופטית של משטח התווית. לחץ על לכידה. חזור להדמיה וסריקה.
נזקי זכוכית מראים שהתווית הודפסה בהצלחה. להזיז את הבמה על ידי אחד לשני שדות הראייה כדי למנוע חלקיקי זכוכית. סרוק כדי לאשר.
בתפריט התקנים, פתח את מאקרו תנועת הבמה. הגדר את המשתנים M ו- N למספר הרצוי של שדות תצוגות שיעצבו. שמור והפעל את המאקרו.
לאחר השלמת התבניות, עבור לתצורה האופטית של התמונה וסרוק את התבניות. לאיי דפוס בכל שדה ראייה צריכים להיות גבולות ברורים ולשקף אור באופן שווה. תבניות שנראות כהות ולא אחידות מרמזות על הסרת PVA לא שלמה.
זה בדרך כלל בגלל כוח לייזר מספיק או מישור מוקד שגוי. אם כוח לייזר מוגדר גבוה מדי, זה יכול גם לגרום PVA לבועה. לאחר ציפוי תאים על coverslips, תאים צריכים להתפשט ולקחת על הצורה של התבנית.
זוהי תמונת כשל חיסוני של פיברובלסט אנושי מצופה בדפוס קשת. התא מציג שפה עשירה במעשה של lamellipodia. סיבי לחץ עבים וגחוניים לאורך שני הצדדים וסיבי הלחץ הגבי המחוברים באמצעות קשתות רוחביות.
שרשרת אור מיוסין ישב מאחורי שפת lamellipodia צפופה והציג דפוס מפוספס לאורך חבילות actin. באמצעות כלי עיבוד התמונה המותאם אישית שלנו, יצרנו תמונה ממוצעת של חלבוני העניין שלנו. תמונה זו מראה כי מבני actin המתוארים לעיל עקביים על פני מספר רב של דפוסים.
למרות שאנו מאבדים מבנים בודדים של מיוסין לאחר ממוצע, זה לוקליזציה לאורך חבילות actin נשמר. לאחר צפייה בסרטון וידאו זה, אתה אמור להיות מסוגל להגדיר זרימת עבודה מיקרו דפוס באמצעות מערכת multiphoton זמין מסחרית עם עבודה ידנית מינימלית. חשוב למטב את עוצמת הלייזר עבור המערכת שלך כדי למנוע יצירת דפוסים לא שלמים או יעילות מרבית PVA ניתן להשיג על ידי התאמת הפרמטרים פוקוס אוטומטי ו micropatterning צעדים.
בנוסף לחקירת מסלולים תאיים המערבים מורפולוגיה של תאים, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על הקרנת סמים ויישומים אחרים הרגישים לווריאציות בצורת התא.
