Mikrostrukturierung ist eine leistungsstarke Technik, die von Wissenschaftlern verwendet wird, um Zusammenhänge zwischen Zellform und der Aktivität interzellulärer Maschinen zu verstehen. Obwohl mehrere Techniken es Forschern ermöglichen, die Zellform zu modulieren, erfordern diese Techniken oft spezielle Geräte, die für einige Biologielabore unzugänglich sind. Dieses Video führt Sie durch die Schritte, die zur Automatisierung der Mikrostrukturierung auf einem kommerziell erhältlichen Multiphotonen-Bildgebungssystem erforderlich sind.

Ein Vorteil dieses Protokolls ist, dass es die Verwendung von Spezialgeräten vermeidet. Muster können auch leicht geändert werden, ohne Fotomasken neu zu bearbeiten, was in der Regel der zeitaufwendigste Prozess beim Mikromustern ist. Unser Bildverarbeitungstool erzeugt durchschnittliche Zellbilder, die eine repräsentative Verteilung von Proteinen unvoreingenommen und automatisiert widerspiegeln.

Obwohl wir in unseren Experimenten Coverlips verwenden, können Sie mit dem automatisierten Workflow auch Dias und Glasbodenschalen mustern. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die richtige Mikroskopeinrichtung für das System entscheidend ist, um die richtige Fokusebene und das richtige Muster automatisiert abbilden, identifizieren zu können. Bereiten Sie die PVA-Lösung wie angewiesen vor.

Fügen Sie ein Teil HCL zu acht Teilen PVA hinzu. Kehren Sie die Röhre vorsichtig ein paar Mal um, um sie zu mischen. Gießen Sie zwei Milliliter der Lösung in eine kleine Petrischale und tauchen Sie einen sauberen vorverarbeiteten Abdeckt in die Flüssigkeit.

Bei Raumtemperatur fünf Minuten auf einem Shaker inkubieren. Entfernen Sie vorsichtig den Abdeck aus der Lösung. Verwenden Sie den Coverslip Spinner, um den Mantel für 40 Sekunden zu spinnen.

In der Zwischenzeit die Pinzette reinigen. Den Abdeck in eine Box überführen und über Nacht bei vier Grad trocknen. Schalten Sie die Mikroskopsoftware ein.

Stellen Sie zunächst die Laserlinie auf 750 Nanometer ein. Richten Sie dann eine neue optische Konfiguration namens Image ein. Dies ist die optische Grundkonfiguration, mit der wir den Abdeckungsschlupf durch Reflektoren abbilden können.

Lassen Sie andere Optionen als Standard und wählen Sie das entsprechende Ziel aus. Konfigurieren Sie die Hardwareeinstellungen unter dieser optischen Konfiguration. Stellen Sie den Infrarotlaser als unseren Stimulationslaser ein.

Platzieren Sie den Strahlteiler in den Lichtweg, um den IR-Laser für die Bildgebung zu verwenden. Wählen Sie die Galvano-Scannereinheit und den entsprechenden D-Scan-Detektor aus. Wählen Sie eine Scangröße und Verweildauer, die ausreicht, um kleine Merkmale auf dem Coverlip zu erfassen.

Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen IR-Laser verwenden aktiviert ist. Passen Sie die Erfassungslaserleistung und die Detektorempfindlichkeit an, um ein helles, aber nicht gesättigtes Bild der Deckdeckeloberfläche zu erhalten. Legen Sie im Scanbereichsfenster den Zoom auf eins fest, um das gesamte Sichtfeld zu erfassen.

Speichern Sie die optische Konfiguration. Jetzt richten wir eine Reihe optischer Konfigurationen ein, die es dem Mikroskop ermöglichen, zu fokussieren, die ROI-Maske zu laden und Muster automatisiert zu generieren. Die erste optische Konfiguration ermöglicht es uns, einen Treuhandmarker zu drucken, der zum automatischen Fokussieren auf das aktuelle Sichtfeld verwendet wird.

Duplizieren Sie die optische Konfiguration des Bildes und benennen Sie sie um, Treuhandmarker drucken. Da wir in diesem Schritt drucken, bewegen Sie den Strahlteiler aus dem Lichtweg und ersetzen Sie ihn durch einen geeigneten dichroitischen Spiegel. Wählen Sie die kleinste Scangröße, um Zeit zu sparen.

Da in diesem Schritt keine Bildgebung erforderlich ist, stellen Sie die Detektorempfindlichkeit auf Null ein. Erhöhen Sie die Laserleistung, um das Drucken zu ermöglichen. Stellen Sie im Scanbereichsfenster den Zoom auf Maximum ein und platzieren Sie den Scanbereich in der Mitte des Sichtfelds.

Jetzt werden wir ein Z-Stack-Experiment einrichten, um Unebenheiten in der PVA-Oberfläche zu berücksichtigen. Stellen Sie die Bewegung an der Z-Position auf relativ ein. Wählen Sie das entsprechende Z-Gerät aus.

Als nächstes duplizieren Sie die optische Konfiguration des Bildes und benennen Sie sie in Autofokus um. Wählen Sie die kleinste Scangröße und verringern Sie den Zoomfaktor im Scanbereichsfenster, sodass das Sichtfeld etwas größer ist als die Treuhandmarkierung. Dies stellt sicher, dass andere kleine Funktionen auf dem Coverlip den Autofokus nicht stören.

Wählen Sie im Menü Geräte die Option Autofokus einrichten aus. Legen Sie die Scandicke auf die im Z-Stack-Experiment fest. Das Mikroskop durchtreift diesen Bereich und findet mit dem Treuhandmarker die beste Fokusebene.

Als nächstes duplizieren Sie die optische Image-Konfiguration und benennen Sie sie in Load ROI um. Stellen Sie die Scangröße identisch mit der roi-Maske ein, da die Maske auf ein Bild geladen wird, das mit dieser optischen Konfiguration aufgenommen wurde. Wir haben 2048 Pixel verwendet, um eine optimale Balance zwischen Auflösung und Geschwindigkeit zu erreichen.

Jetzt werden wir die optische Konfiguration einrichten, die zum Mustern des Coverlips verwendet wird. Duplizieren Sie die optische Konfiguration des Druck-Treuhändermarkers und benennen Sie sie in Micropattern um. Legen Sie den Zoomfaktor auf eins fest.

Erhöhen Sie die Stimulationslaserleistung, um PVA abzunehmen. Wählen Sie eine geeignete Scangeschwindigkeit aus. Richten Sie im ND-Stimulationsfenster ein ND-Stimulationsexperiment ein.

Fügen Sie dem Zeitplan einige Phasen hinzu und stellen Sie jede auf Stimulation ein. Stellen Sie sicher, dass der Stimulationsbereich und die Dauer korrekt sind. Aktivieren Sie im selben Fenster die Haupt-Z-Funktion der Bühnenverschiebung vor jeder Phase.

Dies berücksichtigt wiederum abweichungen in Z-Richtung. Richten Sie schließlich eine optische Konfiguration ein, um ein sichtbares Etikett auf dem Coverlip zu erstellen, das uns helfen kann, die Muster zu lokalisieren. Duplizieren Sie die Druck-Treuhandmarkierung und benennen Sie sie um, Etikettenoberfläche.

Erhöhen Sie die Laserleistung deutlich und stellen Sie den Zoom auf eins. Übertragen Sie den PVA-beschichteten Deckmantel auf eine Halterung. Stellen Sie bei einem aufrechten Mikroskop sicher, dass die PVA-Oberfläche nach unten zeigt.

Fügen Sie Wasser in die Ecken hinzu, um den Abdeckungsrutsch zu stabilisieren. Montieren Sie den Halter auf dem Mikroskopstand. Senken Sie das Objektiv und fügen Sie Wasser dazwischen hinzu.

Schalten Sie in der Mikroskopsoftware den IR-Laserverschluss ein und führen Sie vor der Musterung eine automatische Ausrichtung durch. Wechseln Sie zur optischen Konfiguration des Bildes. Scannen Sie das Sichtfeld, während Sie das Objektiv langsam näher an die Abdeckung bewegen.

Zunächst erscheint das Bild extrem dunkel. Bewegen Sie das Objektiv näher an den Coverlip, bis die Bildhelligkeit leicht zunimmt. Dies ist die Deckrutschfläche, die dem Objektiv zugewandt ist.

Bewegen Sie das Objektiv weiter, bis die Helligkeit abnimmt und wieder zunimmt. Dies ist die PVA-Oberfläche, die wir mustern werden. Konzentrieren Sie sich auf kleine Funktionen, z. B. Abdeckungsfehler oder Staub, und stellen Sie auf dem Laufwerk Z Null ein.

Wechseln Sie zur optischen Konfiguration der Etikettenoberfläche. Klicken Sie auf Aufnehmen. Kehren Sie zu Imaging und Scan zurück.

Glasschäden zeigen, dass das Etikett erfolgreich gedruckt wurde. Verschieben Sie die Bühne um ein bis zwei Sichtfelder, um Glaspartikel zu vermeiden. Scannen zur Bestätigung.

Öffnen Sie im Gerätemenü das Bühnenbewegungsmakro. Setzen Sie die Variablen M und N auf die gewünschte Anzahl von Sichtfelden, die gemustert werden. Speichern Sie das Makro, und führen Sie es aus.

Wechseln Sie nach Abschluss der Musterung zur optischen Konfiguration des Bildes und scannen Sie die Muster. Musterinseln in jedem Sichtfeld sollten klare Grenzen haben und das Licht gleichmäßig reflektieren. Muster, die dunkler und ungleichmäßig erscheinen, deuten auf eine unvollständige PVA-Entfernung hin.

Dies ist in der Regel auf unzureichende Laserleistung oder falsche Fokusebene zurückzuführen. Ist die Laserleistung zu hoch eingestellt, kann dies auch dazu führen, dass die PVA sprudelt. Nach dem Plattieren von Zellen auf Coverlips sollten sich die Zellen ausbreiten und die Form des Musters annehmen.

Dies ist ein Immunfluoreszenzbild eines menschlichen Fibroblasten, der auf einem Armbrustmuster plattiert ist. Die Zelle zeigt einen aktinreichen Rand von Lamellipodie. Dicke, ventrale Spannungsfasern entlang der beiden Seiten und dorsale Spannungsfasern, die durch Querbögen verbunden sind.

Myosin-Lichterkette saß hinter dem dichten Lamellipodia-Rand und zeigte ein streifiges Muster entlang von Aktinbündeln. Mit unserem benutzerdefinierten Bildverarbeitungstool haben wir ein gemitteltes Bild unserer interessierenden Proteine erstellt. Dieses Bild zeigt, dass die oben beschriebenen Aktinstrukturen über eine große Anzahl von Mustern konsistent sind.

Obwohl wir nach der Mittelung einzelne Strukturen von Myosin verlieren, bleibt die Lokalisierung entlang von Aktinbündeln erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, einen Micro-Patterning-Workflow mit einem kommerziell erhältlichen Multiphotonensystem mit minimalem manuellen Aufwand einzurichten. Es ist wichtig, die Laserleistung für Ihr eigenes System zu optimieren, um unvollständige Muster oder PVA zu vermeiden Maximale Effizienz kann durch Anpassung der Parameter in Autofokus- und Mikrostrukturierungsschritten erreicht werden.

Neben der Untersuchung zellulärer Signalwege mit Zellmorphologie kann diese Technik auch auf das Screening von Medikamenten und andere Anwendungen angewendet werden, die empfindlich auf Variationen der Zellform reagieren.