マイクロパターニングは、細胞の形状と細胞間機械の活動との関係を理解するために科学者によって採用される強力な技術です。いくつかの技術は、研究者が細胞の形状を調節することを可能にしますが、これらの技術は、多くの場合、いくつかの生物学の研究室にアクセスできない特殊な機器を必要とします。このビデオでは、市販のマルチフォトンイメージングシステムでマイクロパターン化を自動化するために必要な手順について説明します。
このプロトコルの利点の 1 つは、特殊な機器の使用を回避することです。また、フォトマスクを再作製することなくパターンを容易に変更することもできます。当社の画像処理ツールは、タンパク質の代表的な分布を公平かつ自動化された方法で反映した平均細胞画像を生成します。
実験ではカバーリップを使用していますが、自動ワークフローではスライドやガラス底の皿をパターン化することもできます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、システムがイメージを作成し、正しい焦点面を識別し、自動化された方法でパターンを識別するために適切な顕微鏡のセットアップが重要であるため、重要です。指示に従ってPVA溶液を準備する。
8 つのパーツ PVA に 1 つのパーツ HCL を追加します。チューブを慎重に数回反転して混ぜます。小さなペトリ皿に溶液の2ミリリットルを注ぎ、液体にきれいな前処理カバースリップを水没させます。
シェーカーで室温で5分間インキュベートします。慎重に溶液からカバースリップを取り外します。カバースリップスピナーを使用して、40秒間コートを回転させます。
その間に、ピンセットをきれいにします。カバースリップを箱に移し、一晩で4度乾かします。顕微鏡ソフトウェアをオンにします。
まず、レーザーラインを750ナノメートルに設定します。次に、イメージという新しい光学式構成を設定します。これは、反射光を通してカバースリップをイメージ化することを可能にするベースライン光学構成です。
他のオプションをデフォルトのままにして、適切な目標を選択します。この光の構成でハードウェア設定を構成します。赤外線レーザーを刺激レーザーとして設定します。
光の経路にビームスプリッタを配置し、IRレーザーを使用してイメージングします。ガルヴァーノスキャナユニットと適切なDスキャン検出器を選択します。カバースリップ上の小さなフィーチャをキャプチャするのに十分なスキャン サイズとドウェル時間を選択します。
[IR レーザーを使用]ボックスがオンになっていることを確認します。取得レーザーパワーと検出器感度を調整して、カバースリップ表面の明るい、しかし飽和していない画像を得る。スキャンエリアウィンドウで、ズームを1に設定して、視野全体をキャプチャします。
オプティカル構成を保存します。今度は、顕微鏡が焦点を合わせ、ROIマスクをロードし、自動化された方法でパターンを生成できるようにする一連の光学的構成を設定します。最初の光学式構成により、現在の視野に自動焦点を当てるために使用される受託者マーカーを印刷することができます。
画像光学構成を複製し、それを名前変更, 印刷受託マーカー.このステップでは印刷中なので、光路からビームスプリッターを移動し、適切な二色鏡に置き換えます。時間を節約するために、スキャンの最小サイズを選択します。
このステップではイメージングが不要なので、検出器感度をゼロに設定します。印刷を可能にするには、レーザーパワーを上げます。スキャンエリアウィンドウで、ズームを最大に設定し、スキャンエリアを視野の中央に配置します。
次に、PVA サーフェスの不均等を考慮して Z スタック実験を設定します。Z 位置の移動を相対位置に設定します。適切な Z デバイスを選択します。
次に、画像光学構成を複製し、オートフォーカスの名前を変更します。スキャンの最小サイズを選択し、スキャン領域ウィンドウのズーム倍率を小さくして、視野が受託マーカーよりわずかに大きくなるようにします。これにより、カバースリップ上の他の小さなフィーチャーが自動焦点を妨げなくなります。
[デバイス]メニューで、[自動フォーカス設定]を選択します。Z スタック実験でスキャンの厚さを設定します。顕微鏡はこの範囲をスキャンし、受託者マーカーを使用して最もよい焦点面を見つける。
次に、イメージ光学構成を複製し、その名前を変更して ROI を読み込みます。この光学式構成で撮影した画像にマスクがロードされるため、ROMIマスクと同じスキャンサイズを設定します。解像度と速度の最適なバランスを実現するために、2048ピクセルを使用しました。
次に、カバースリップのパターン化に使用する光学式構成を設定します。印刷受託者マーカー光学構成を複製し、それを名前変更する、マイクロパターン。ズーム倍率を 1 に設定します。
PVAを減退させるために刺激レーザーパワーを増加させます。適切なスキャン速度を選択します。ND刺激ウィンドウで、ND刺激実験を設定します。
時間スケジュールにいくつかのフェーズを追加し、刺激でそれぞれを設定します。刺激領域と持続時間が正しいことを確認します。同じウィンドウで、ステージ移動のメイン Z 関数を各フェーズの前に有効にします。
この場合も、Z 方向の偏差が含まれます。最後に、パターンの特定に役立つカバースリップに目に見えるラベルを作成する光学式構成を設定します。印刷受託マーカーを複製し、それを名前を変更,ラベルサーフェス。
レーザーパワーを大幅に増加させ、ズームを1に設定します。PVAコーティングされたカバースリップをホルダーに移します。直立顕微鏡の場合は、PVA表面が下向きであることを確認します。
カバースリップを安定させるためにコーナーに水を加えます。ホルダーを顕微鏡ステージに取り付けます。目的を下げ、その間に水を加えます。
顕微鏡ソフトでは、IRレーザーシャッターをオンにして、パターニングの前に自動調整を行います。イメージ光構成に切り替えます。カバースリップにゆっくりと目的を近づけながら、視野をスキャンします。
最初は、画像が非常に薄暗く表示されます。画像の明るさがわずかに高くなるまで、目的をカバースリップに近づけます。これは、目的に向いているカバースリップサーフェスです。
明るさが減少し、再び増加するまで、目的を移動し続けます。これは我々がパターン化するPVA表面です。カバースリップの欠陥やほこりなどの小さな機能に焦点を当て、Zドライブにゼロを設定します。
ラベル表面の光学構成に切り替えます。[キャプチャ]をクリックします。イメージングとスキャンに戻ります。
ガラスの破損は、ラベルが正常に印刷されたことを示しています。ガラス粒子を避けるために、ステージを 1 ~ 2 つの視野で移動します。確認するためにスキャンします。
デバイスメニューで、ステージ移動マクロを開きます。変数 M と N を、パターン化するビューのフィールドの必要な数に設定します。マクロを保存して実行します。
パターニングが完了したら、画像光学構成に切り替えてパターンをスキャンします。各視野のパターンアイランドは、明確な境界線を持ち、光を均等に反射する必要があります。暗く不均一に見えるパターンは、不完全な PVA 除去を示唆しています。
これは通常、レーザーパワーが不十分であるか、または誤った焦点面が原因です。レーザーパワーが高すぎると、PVAが泡立つ原因となる可能性もあります。細胞を覆わす上でめっきした後、細胞は広がり、パターンの形を取る必要があります。
クロスボウパターンにメッキされたヒト線維芽細胞の蛍光画像です。セルはラメリポディアのアクチンが豊富な縁を表示します。両側に沿った厚い腹側応力繊維と、横円弧によって接続された後部応力繊維。
ミオシン軽鎖は密なラメリポディアリムの後ろに座り、アクチンバンドルに沿って縞模様を表示した。カスタム画像処理ツールを使用して、目的のタンパク質の平均画像を生成しました。この画像は、上記のアクチン構造が多数のパターンにわたって一貫していることを示しています。
我々は、平均化した後にミオシンの個々の構造を失うが、それはアクチンバンドルに沿って局在化が保存されています。このビデオを見た後、最小限の手作業で市販のマルチフォトンシステムを使用してマイクロパターニングワークフローを設定できるはずです。不完全なパターンを生成しないように、またはPVA最大効率を自動焦点とマイクロパターン化のステップでパラメータを調整することによって達成できるように、システム用のレーザーパワーを最適化することが重要です。
細胞形態を含む細胞経路の調査に加えて、この技術は、細胞の形状の変化に敏感な薬物スクリーニングおよび他のアプリケーションにも適用することができる。
