Il micropatterning è una potente tecnica utilizzata dagli scienziati per comprendere le connessioni tra la forma cellulare e l'attività delle macchine intercellulari. Sebbene diverse tecniche consentano ai ricercatori di modulare la forma cellulare, queste tecniche spesso richiedono attrezzature specializzate inaccessibili ad alcuni laboratori di biologia. Questo video ti guiderà attraverso i passaggi necessari per automatizzare il micropatterning su un sistema di imaging multifotono disponibile in commercio.
Un vantaggio di questo protocollo è che evita l'uso di attrezzature specializzate. I modelli possono anche essere facilmente modificati senza rifrattare le fotomaschere, che in genere è il processo più dispendioso in termini di tempo nel micropatterning. Il nostro strumento di elaborazione delle immagini genera immagini cellulari medie che riflettono una distribuzione rappresentativa delle proteine in modo imparziale e automatizzato.
Sebbene utilizziamo coverlips nei nostri esperimenti, il flusso di lavoro automatizzato consente anche di creare modelli su diapositive e piatti con fondo di vetro. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante poiché una corretta configurazione del microscopio è fondamentale per l'immagine del sistema, l'identificazione del piano focale corretto e il modello in modo automatizzato. Preparare la soluzione PVA secondo le istruzioni.
Aggiungere una parte HCL a otto parti PVA. Invertire attentamente il tubo alcune volte per mescolare. Versare due millilitri della soluzione in una piccola piastra di Petri e immergere una coverlip pre-lavorata pulita nel liquido.
Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti su uno shaker. Rimuovere con cura il coverslip dalla soluzione. Utilizzare lo spinner coverslip per ruotare il cappotto per 40 secondi.
Nel frattempo, pulisci le pinzette. Trasferire il coverslip in una scatola e asciugare a quattro gradi durante la notte. Attivare il software per microscopio.
Per prima cosa, imposta la linea laser su 750 nanometri. Quindi impostare una nuova configurazione ottica chiamata Image. Questa è la configurazione ottica di base che ci permette di immagine del coverslip attraverso i riflettori.
Lasciare altre opzioni come predefinite e selezionare l'obiettivo appropriato. Configurare le impostazioni hardware in questa configurazione ottica. Imposta il laser a infrarossi come laser di stimolazione.
Posizionare lo splitter del fascio nel percorso della luce per utilizzare il laser IR per l'imaging. Selezionare l'unità scanner Galvano e il rilevatore di scansione D appropriato. Selezionare una dimensione di scansione e un tempo di soffermazione sufficiente per acquisire piccole feature sul coverslip.
Verificare che la casella Usa laser a infrarossi sia selezionata. Regolare la potenza del laser di acquisizione e la sensibilità del rivelatore per ottenere un'immagine luminosa, ma non satura, della superficie del coverslip. Nella finestra dell'area di scansione impostare lo zoom su uno per acquisire l'intero campo visivo.
Salvare la configurazione ottica. Ora setteremo una serie di configurazioni ottiche che permetteranno al microscopio di mettere a fuoco, caricare la maschera ROI e generare modelli in modo automatizzato. La prima configurazione ottica ci consente di stampare un marcatore fiduciario utilizzato per mettere a fuoco automaticamente l'attuale campo visivo.
Duplicare la configurazione ottica dell'immagine e rinominarla, Stampa marcatore fiduciario. Poiché stiamo stampando in questo passaggio, spostare lo splitter del fascio fuori dal percorso della luce e sostituirlo con un adeguato specchio dicroico. Selezionare le dimensioni di scansione più piccole per risparmiare tempo.
Poiché non è richiesta alcuna immagine in questo passaggio, impostare la sensibilità del rilevatore su zero. Aumentare la potenza del laser per consentire la stampa. Nella finestra dell'area di scansione impostare lo zoom sul massimo e posizionare l'area di scansione al centro del campo visivo.
Ora creeremo un esperimento Z-stack per tenere conto di eventuali irregolarità nella superficie del PVA. Impostare il movimento nella posizione Z su relativo. Selezionare il dispositivo Z appropriato.
Quindi, duplica la configurazione ottica dell'immagine e rinominala, Messa a fuoco automatica. Selezionare la dimensione di scansione più piccola e ridurre il fattore di zoom nella finestra dell'area di scansione in modo che il campo visivo sia leggermente più grande del marcatore fiduciario. Ciò garantisce che altre piccole feature sul coverslip non interferiscano con l'autofocus.
Nel menu Dispositivi selezionare Configurazione messa a fuoco automatica. Impostate lo spessore della scansione su quello dell'esperimento Z-stack. Il microscopio eseguirà la scansione di questa gamma e troverà il miglior piano focale utilizzando il marcatore fiduciario.
Quindi, duplica la configurazione ottica dell'immagine e rinominala, Carica ROI. Impostare la dimensione di scansione identica a quella della maschera ROI perché la maschera verrà caricata su un'immagine scattata con questa configurazione ottica. Abbiamo usato i pixel 2048 per raggiungere un equilibrio ottimale tra risoluzione e velocità.
Ora impostaremo la configurazione ottica utilizzata per modellare il coverslip. Duplicare la configurazione ottica del marcatore fiduciario di stampa e rinominarla Micropattern. Impostare il fattore di zoom su uno.
Aumentare la potenza del laser di stimolazione per abiurare il PVA. Selezionare una velocità di scansione appropriata. Nella finestra di stimolazione ND, impostare un esperimento di stimolazione ND.
Aggiungere alcune fasi al programma di tempo e impostarne ognuna alla stimolazione. Assicurarsi che l'area di stimolazione e la durata siano corrette. Nella stessa finestra, abilitare la funzione Z principale dello spostamento dello stadio prima di ogni fase.
Anche in questo caso si spiegano eventuali deviazioni nella direzione Z. Infine, impostare una configurazione ottica per creare un'etichetta visibile sul copripasto che possa aiutarci a individuare i motivi. Duplicare il marcatore fiduciario di stampa e rinominarlo, Etichetta superficie.
Aumentare significativamente la potenza del laser e impostare lo zoom su uno. Trasferire la coverslip rivestita in PVA su un supporto. Per un microscopio verticale, assicurate che la superficie del PVA sia a faccia in giù.
Aggiungere acqua agli angoli per stabilizzare il coverslip. Montare il supporto sullo stadio del microscopio. Abbassare l'obiettivo e aggiungere acqua nel mezzo.
Nel software al microscopio, accendere l'otturatore laser a infrarossi ed eseguire l'allineamento automatico prima della creazione di modelli. Passare alla configurazione ottica dell'immagine. Scansiona il campo visivo mentre avvicini lentamente l'obiettivo al coverslip.
All'inizio, l'immagine apparirà estremamente fioca. Avvicinare l'obiettivo al coverslip fino a quando la luminosità dell'immagine non aumenta leggermente. Questa è la superficie di coverlip che si affaccia sull'obiettivo.
Continuare a spostare l'obiettivo fino a quando la luminosità diminuisce e aumenta di nuovo. Questa è la superficie del PVA che faremo un modello. Concentrati su qualsiasi piccola caratteristica, come imperfezioni dei copriscili o polvere, e imposta zero sull'unità Z.
Passare alla configurazione ottica della superficie dell'etichetta. Clicca su Cattura. Tornare all'imaging e alla scansione.
I danni al vetro dimostrano che l'etichetta è stata stampata con successo. Spostare lo stadio di uno o due campi visivo per evitare particelle di vetro. Eseguire la scansione per confermare.
Nel menu dispositivi aprire la macro movimento palco. Impostare le variabili M e N sul numero desiderato di campi di viste che verranno modellati. Salvare ed eseguire la macro.
Al termine della creazione di modelli, passare alla configurazione ottica dell'immagine e eseguire la scansione attraverso i modelli. Le isole modello in ogni campo visivo dovrebbero avere confini chiari e riflettere la luce in modo uniforme. I modelli che appaiono più scuri e irregolari suggeriscono la rimozione incompleta del PVA.
Ciò è di solito dovuto all'insufficiente potenza del laser o al piano focale errato. Se l'alimentazione laser è impostata su un valore troppo alto, può anche far bollire il PVA. Dopo aver placcato le cellule sui coprispasmi, le cellule dovrebbero diffondersi e assumere la forma del modello.
Questa è un'immagine di immunofluorescenza di un fibroblasto umano placcato su un motivo a balestra. La cellula mostra un bordo ricco di actina di lamellipodia. Spesse fibre di stress ventrale lungo i due lati e fibre di stress dorsale collegate da archi trasversali.
La catena di luce del miosina sedeva dietro il denso bordo della lamellipodia e mostrava un motivo striato lungo fasci di actin. Utilizzando il nostro strumento di elaborazione delle immagini personalizzato, abbiamo generato un'immagine media delle nostre proteine di interesse. Questa immagine mostra che le strutture actin sopra descritte sono coerenti in un gran numero di modelli.
Anche se perdiamo singole strutture di miosina dopo la media, è la localizzazione lungo i fasci actin è conservata. Dopo aver guardato questo video, dovresti essere in grado di impostare un flusso di lavoro di micro patterning utilizzando un sistema multifoton disponibile in commercio con un lavoro manuale minimo. È importante ottimizzare la potenza del laser per il proprio sistema per evitare di generare modelli incompleti o PVA La massima efficienza può essere raggiunta regolando i parametri nelle fasi di autofocus e micropatterning.
Oltre a studiare le vie cellulari che coinvolgono la morfologia cellulare, questa tecnica può essere applicata anche allo screening farmacologico e ad altre applicazioni sensibili alle variazioni nella forma cellulare.
