Micropatterning es una técnica de gran alcance empleada por los científicos para entender las conexiones entre la forma de la célula y la actividad de las máquinas intercelulares. Aunque varias técnicas permiten a los investigadores modular la forma celular, estas técnicas a menudo requieren equipos especializados inaccesibles para algunos laboratorios de biología. Este video lo guiará a través de los pasos necesarios para automatizar el micropatterning en un sistema de imágenes multifotón disponible en el comercio.
Una ventaja de este protocolo es que evita el uso de equipos especializados. Los patrones también se pueden cambiar fácilmente sin refabricar las fotomáscaras, que suele ser el proceso que más tiempo consume en micropatterning. Nuestra herramienta de procesamiento de imágenes genera imágenes celulares promedio que reflejan una distribución representativa de las proteínas de una manera imparcial y automatizada.
Aunque utilizamos cubrebocas en nuestros experimentos, el flujo de trabajo automatizado también le permite modelar en diapositivas y platos con fondo de vidrio. La demostración visual de este método es importante puesto que la configuración apropiada del microscopio es crítica para que el sistema a la imagen, a identificar el plano focal correcto, y al patrón de una manera automatizada. Prepare la solución de PVA según las instrucciones.
Añada una parte HCL a ocho partes PVA. Invierta el tubo cuidadosamente unas cuantas veces para mezclar. Vierta dos mililitros de la solución en una pequeña placa de Petri y sumerja una cubierta limpia preprocesada en el líquido.
Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos en una coctelera. Retire cuidadosamente el cubrebocas de la solución. Utilice el spinner coverslip para girar la capa durante 40 segundos.
Mientras tanto, limpie las pinzas. Transfiera el cubrebocas a una caja y seque a cuatro grados durante la noche. Encienda el software del microscopio.
En primer lugar, establezca la línea láser en 750 nanómetros. A continuación, configure una nueva configuración óptica llamada Imagen. Esta es la configuración óptica de línea base que nos permite obtener imágenes del cubrebocas a través de reflectantes.
Deje otras opciones como predeterminadas y seleccione el objetivo adecuado. Configure las configuraciones de hardware bajo esta configuración óptica. Establezca el láser infrarrojo como nuestro láser de estimulación.
Coloque el divisor de haz en la ruta de luz para utilizar el láser IR para la obtención de imágenes. Seleccione la unidad de escáner Galvano y el detector de escaneo D apropiado. Seleccione un tamaño de escaneo y un tiempo de permanencia que sea suficiente para capturar entidades pequeñas en el cubrebocas.
Asegúrese de que la casilla Usar láser IR esté marcada. Ajuste la potencia del láser de adquisición y la sensibilidad del detector para obtener una imagen brillante, pero no saturada, de la superficie del cubrebocas. En la ventana del área de escaneo, establezca el zoom en uno para capturar todo el campo de visión.
Guarde la configuración óptica. Ahora configuraremos una serie de configuraciones ópticas que permitirán enfocar el microscopio, cargar la máscara de ROI y generar patrones de manera automatizada. La primera configuración óptica nos permite imprimir un marcador fiduciario utilizado para auto-enfocar en el campo de visión actual.
Duplique la configuración óptica de la imagen y cámbiele el nombre, Imprimir marcador fiduciario. Ya que estamos imprimiendo en este paso, mueva el divisor de haz fuera de la ruta de luz y reemplácelo con un espejo dicroico apropiado. Seleccione el tamaño de escaneo más pequeño para ahorrar tiempo.
Dado que no se requiere ninguna imagen en este paso, establezca la sensibilidad del detector en cero. Aumente la potencia del láser para permitir la impresión. En la ventana del área de escaneo, establezca zoom en máximo y coloque el área de escaneo en el centro del campo de visión.
Ahora configuraremos un experimento de pila Z para tener en cuenta cualquier irregularidad en la superficie de PVA. Establezca el movimiento en la posición Z en relativo. Seleccione el dispositivo Z adecuado.
A continuación, duplique la configuración óptica de la imagen y cámbiele el nombre a Enfoque automático. Seleccione el tamaño de escaneo más pequeño y disminuya el factor de zoom en la ventana del área de escaneo para que el campo de visión sea ligeramente mayor que el marcador fiduciario. Esto garantiza que otras entidades pequeñas en el cubrebocas no interfieran con el enfoque automático.
En el menú Dispositivos, seleccione Configuración de enfoque automático. Establezca el grosor de escaneo en el experimento de la pila Z. El microscopio escaneará a través de este rango y encontrará el mejor plano focal utilizando el marcador fiduciario.
A continuación, duplique la configuración óptica de la imagen y cámbiele el nombre a Load ROI. Establezca el tamaño de escaneo idéntico al de la máscara roi porque la máscara se cargará en una imagen tomada con esta configuración óptica. Utilizamos 2048 píxeles para lograr un equilibrio óptimo entre resolución y velocidad.
Ahora vamos a configurar la configuración óptica utilizada para modelar el cubrebocas. Duplique la configuración óptica del marcador fiduciario de impresión y cámbiele el nombre a Micropattern. Establezca el factor de zoom en uno.
Aumentar la potencia del láser de estimulación para ablatar PVA. Seleccione una velocidad de escaneo adecuada. En la ventana de estimulación del DE, configure un experimento de estimulación del DE.
Agregue algunas fases al horario y establezca cada una en la estimulación. Asegúrese de que el área de estimulación y la duración sean correctas. En la misma ventana, habilite la función Z principal de movimiento de escenario antes de cada fase.
Esto nuevamente explica cualquier desviación en la dirección Z. Por último, configurar una configuración óptica para hacer una etiqueta visible en la cubierta que nos puede ayudar a localizar los patrones. Duplique el marcador fiduciario de impresión y cámbiele el nombre a Superficie de etiqueta.
Aumente significativamente la potencia del láser y establezca el zoom en uno. Transfiera el cubrebocas recubierto de PVA a un soporte. Para un microscopio vertical, asegúrese de que la superficie de PVA se enferrique hacia abajo.
Agregue agua a las esquinas para estabilizar el cubrebocas. Monte el soporte en la etapa del microscopio. Baje el objetivo y agregue agua en el medio.
En el software del microscopio, encienda el obturador láser IR y realice la alineación automática antes del modelado. Cambie a la configuración óptica de la imagen. Escanee el campo de visión mientras mueve lentamente el objetivo más cerca del cubrebocas.
Al principio, la imagen aparecerá extremadamente tenue. Mueva el objetivo más cerca del cubrebocas hasta que el brillo de la imagen aumente ligeramente. Esta es la superficie de la cubierta que se enfrenta al objetivo.
Continúe moviendo el objetivo hasta que el brillo disminuya y aumente de nuevo. Esta es la superficie PVA que modelaremos. Concéntrese en cualquier característica pequeña, como imperfecciones de cubrebocas o polvo, y establezca cero en la unidad Z.
Cambie a la configuración óptica de la superficie de la etiqueta. Haga clic en Capturar. Vuelva a la toma de imágenes y la exploración.
El daño en el vidrio muestra que la etiqueta se ha impreso con éxito. Mueva el escenario de uno a dos campos de visión para evitar partículas de vidrio. Analizar para confirmar.
En el menú de dispositivos, abra la macro de movimiento del escenario. Establezca las variables M y N en el número deseado de campo de vistas que se modelará. Guarde y ejecute la macro.
Una vez completado el modelado, cambie a la configuración óptica de la imagen y escanee los patrones. Las islas de patrón en cada campo de visión deben tener bordes claros y reflejar la luz uniformemente. Los patrones que parecen más oscuros y desiguales sugieren la eliminación incompleta de PVA.
Esto es generalmente debido a la potencia insuficiente del láser o plano focal incorrecto. Si la potencia del láser se establece demasiado alta, también puede hacer que el PVA burbujee. Después de enchapar las celdas en los cubrebocas, las células deben extenderse y tomar la forma del patrón.
Ésta es una imagen de la inmunofluorescencia de un fibroblasto humano plateado en un patrón de la ballesta. La célula muestra un borde rico en actina de lamellipodia. Fibras de tensión ventral gruesas a lo largo de los dos lados y fibras de tensión dorsal conectadas por arcos transversales.
La cadena ligera de la miosina se sentó detrás del denso borde del lamellipodia y exhibió un patrón estriado a lo largo de haces de la actina. Utilizando nuestra herramienta de procesamiento de imágenes personalizada, generamos una imagen promediada de nuestras proteínas de interés. Esta imagen muestra que las estructuras de actina descritas anteriormente son consistentes en un gran número de patrones.
Aunque perdemos estructuras individuales de miosina después de promediar, se conserva su localización a lo largo de haces de actina. Después de ver este video, debería poder configurar un flujo de trabajo de micro patrones utilizando un sistema multifotón disponible en el comercio con un trabajo manual mínimo. Es importante optimizar la potencia del láser para su propio sistema para evitar la generación de patrones incompletos o PVA La máxima eficiencia se puede lograr ajustando los parámetros en los pasos de enfoque automático y micropatterning.
Además de investigar las vías celulares que involucran la morfología celular, esta técnica también se puede aplicar a la detección de fármacos y otras aplicaciones que son sensibles a las variaciones en la forma celular.
