Микроструктурирование является мощным методом, используемым учеными для понимания связей между формой клеток и активностью межклеточных машин. Хотя несколько методов позволяют исследователям модулировать форму клеток, эти методы часто требуют специализированного оборудования, недоступного для некоторых биологических лабораторий. Это видео проведет вас через шаги, необходимые для автоматизации микроструктурирования на коммерчески доступной многофотонной системе визуализации.
Одним из преимуществ этого протокола является то, что он позволяет избежать использования специализированного оборудования. Шаблоны также могут быть легко изменены без рефабрикации фотомаски, что, как правило, является наиболее трудоемким процессом в микроструктурировании. Наш инструмент обработки изображений генерирует средние изображения клеток, которые отражают репрезентативное распределение белков непредвзятым и автоматизированным образом.
Хотя мы используем чехлы в наших экспериментах, автоматизированный рабочий процесс также позволяет создавать узоры на слайдах и стеклянной посуде. Визуальная демонстрация этого метода важна, поскольку правильная настройка микроскопа имеет решающее значение для системы, чтобы получить изображение, определить правильную фокальную плоскость и шаблон автоматическим образом. Приготовьте раствор ПВА в соответствии с инструкциями.
Добавьте одну часть HCL к восьми частям PVA. Осторожно переверкнуйте трубку несколько раз, чтобы перемешать. Налейте два миллилитра раствора в небольшую чашку Петри и погрузите в жидкость чистый предварительно обработанный покров.
Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут на шейкере. Осторожно извлеките крышку из раствора. Используйте спиннер для вращения покрова в течение 40 секунд.
А пока очистите пинцет. Переложите крышку в коробку и высушите при четырех градусах в течение ночи. Включите программное обеспечение микроскопа.
Во-первых, установите лазерную линию на 750 нанометров. Затем настройте новую оптическую конфигурацию под названием Image. Это базовая оптическая конфигурация, которая позволяет нам получать изображения крышки через отражатели.
Оставьте другие параметры по умолчанию и выберите соответствующую цель. Настройте параметры оборудования в этой оптической конфигурации. Установите инфракрасный лазер в качестве нашего стимулирующего лазера.
Поместите светоотвод в световой контур, чтобы использовать ИК-лазер для визуализации. Выберите блок сканера Galvano и соответствующий детектор D-сканирования. Выберите размер сканирования и время выдержки, достаточные для захвата небольших объектов на обложке.
Убедитесь, что установлен флажок Использовать ИК-лазер. Отрегулируйте мощность лазера и чувствительность детектора для получения яркого, но не насыщенного изображения поверхности крышки. В окне области сканирования установите масштаб на один, чтобы захватить все поле зрения.
Сохраните оптическую конфигурацию. Теперь мы настроим серию оптических конфигураций, которые позволят микроскопу фокусироваться, загружать маску ROI и генерировать шаблоны автоматически. Первая оптическая конфигурация позволяет нам печатать фидуциарный маркер, используемый для автофокусировки на текущем поле зрения.
Продублируйте оптическую конфигурацию изображения и переименуйте ее, Печать фидуциарного маркера. Поскольку мы печатаем на этом этапе, переместите светоотвод из светового контура и замените его соответствующим дихроичным зеркалом. Выберите наименьший размер сканирования, чтобы сэкономить время.
Поскольку на этом этапе визуализация не требуется, установите чувствительность детектора на ноль. Увеличьте мощность лазера, чтобы включить печать. В окне области сканирования установите максимальный масштаб и поместите область сканирования в середину поля зрения.
Теперь мы настроим эксперимент Z-стека для учета любых неровностей на поверхности ПВА. Установите движение в положении Z в относительное. Выберите соответствующее устройство Z.
Затем продублируйте оптическую конфигурацию изображения и переименуйте ее в Автофокус. Выберите наименьший размер сканирования и уменьшите коэффициент масштабирования в окне области сканирования, чтобы поле зрения было немного больше фидуциарного маркера. Это гарантирует, что другие небольшие функции на крышке не будут мешать автофокусировке.
В меню Устройства выберите настройка автофокусировки. Установите толщину сканирования на такую в эксперименте Z-stack. Микроскоп будет сканировать этот диапазон и находить лучшую фокальную плоскость с помощью фидуциарного маркера.
Затем продублируйте оптическую конфигурацию изображения и переименуйте ее, Load ROI. Установите размер сканирования, идентичный размеру маски ROI, поскольку маска будет загружена на изображение, снятое с помощью этой оптической конфигурации. Мы использовали 2048 пикселей для достижения оптимального баланса между разрешением и скоростью.
Теперь мы настроим оптическую конфигурацию, используемую для создания шаблона крышки. Продублируйте оптическую конфигурацию фидуциарного маркера печати и переименуйте ее в Micropattern. Установите коэффициент масштабирования на один.
Увеличьте мощность стимулирующего лазера для абляции ПВА. Выберите подходящую скорость сканирования. В окне стимуляции ND настройте эксперимент по стимуляции ND.
Добавьте несколько фаз в график времени и установите каждую на стимуляцию. Убедитесь, что область и продолжительность стимуляции являются правильными. В этом же окне включите главную функцию перемещения этапа Z перед каждым этапом.
Это опять же объясняет любые отклонения в направлении Z. Наконец, настройте оптическую конфигурацию, чтобы сделать видимую метку на крышке, которая может помочь нам найти шаблоны. Продублируйте фидуциарный маркер печати и переименуйте его в Поверхность этикетки.
Значительно увеличьте мощность лазера и установите масштаб на один. Перенесите крышку с ПВА-покрытием на держатель. Для вертикального микроскопа убедитесь, что поверхность ПВА обращена вниз.
Добавьте воду в углы, чтобы стабилизировать крышку. Установите держатель на ступень микроскопа. Опустойте цель и добавьте воду между ними.
В программном обеспечении микроскопа включите ИК-лазерный затвор и выполните автоматическое выравнивание перед рисунком. Переключитесь на оптическую конфигурацию изображения. Сканируйте поле зрения, медленно перемещая цель ближе к крышке.
Сначала изображение будет казаться крайне тусклым. Переместите объектив ближе к крышке, пока яркость изображения немного не увеличится. Это поверхность крышки, которая обращена к цели.
Продолжайте перемещать объект до тех пор, пока яркость не уменьшится и не увеличится снова. Это поверхность ПВА, которую мы будем моделть. Сосредоточьтесь на любой небольшой функции, такой как несовершенства крышки или пыль, и установите ноль на Z-диске.
Переключитесь на оптическую конфигурацию поверхности этикетки. Нажмите «Захват». Вернитесь к визуализации и сканированию.
Повреждение стекла показывает, что этикетка была успешно напечатана. Перемещайте сцену на одно-два поля зрения, чтобы избежать частиц стекла. Сканирование для подтверждения.
В меню устройств откройте макрос перемещения рабочей области. Задайте для переменных M и N нужное количество полей представлений, которые будут шаблонными. Сохраните и запустите макрос.
После завершения разработки шаблонов переключитесь на оптическую конфигурацию изображения и просканируйте шаблоны. Узор островов в каждом поле зрения должен иметь четкие границы и равномерно отражать свет. Узоры, которые кажутся более темными и неровными, предполагают неполное удаление ПВА.
Обычно это происходит из-за недостаточной мощности лазера или неправильной фокальной плоскости. Если мощность лазера установлена слишком высоко, это также может привести к пузырьку ПВА. После нанесения покрытий на покровные листы клетки должны распространиться и принять форму узора.
Это иммунофлуоресцентное изображение фибробластов человека, покрытое рисунком арбалета. Клетка отображает богатый актинами ободок ламеллиподий. Толстые, вентральные напряженные волокна вдоль двух сторон и дорсальные напряженные волокна, соединенные поперечными дугами.
Легкая цепь миозина сидела за плотным ободом ламеллиподии и демонстрировала полосатый рисунок вдоль пучков актина. Используя наш пользовательский инструмент обработки изображений, мы создали усредненное изображение интересующих нас белков. Это изображение показывает, что актиновые структуры, описанные выше, согласованы по большому количеству паттернов.
Хотя мы теряем отдельные структуры миозина после усреднения, его локализация вдоль пучков актина сохраняется. После просмотра этого видео вы сможете настроить рабочий процесс микроструктурирования с помощью коммерчески доступной многофотонной системы с минимальным ручным трудом. Важно оптимизировать мощность лазера для вашей собственной системы, чтобы избежать создания неполных шаблонов или ПВА Максимальная эффективность может быть достигнута путем регулировки параметров в шагах автофокусировки и микроструктурирования.
В дополнение к исследованию клеточных путей, связанных с морфологией клеток, этот метод также может быть применен к скринингу лекарств и другим приложениям, которые чувствительны к изменениям формы клеток.
