يصف هذا البروتوكول الإجراءات والخطوات الحاسمة للمستحضرات الزائفة لفيروس أنفلونزا الطيور H5 عالي مسببات الأمراض ومقايسات تحييد الفيروس الزائف. كما يناقش قيود استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتعديلات هذه المقايسات. يجب إجراء مسببات الأمراض شديدة الإمراض في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى الثالث ، في حين يمكن التعامل مع الفيروسات الزائفة بأمان في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى الثاني.
للبدء ، قم بعمل تعليق خلية واحدة لخلايا HEK293 FT في وسط DMEM كامل. أضف 10 ملليلتر من معلق الخلية الواحدة إلى دورق T75 ، متبوعا بالحضانة عند 37 درجة مئوية. قبل ساعتين من النقل ، استبدل الوسط القديم ب 10 ملليلتر من الوسط الكامل الطازج بالكلوروكين.
امزج الكواشف والحمض النووي البلازميد كما هو موضح في المخطوطة ثم انقل هذا الخليط إلى الوسط فوق الخلايا واصخره برفق. بعد الحضانة ، استبدل الوسط ب 15 مل من وسط DMEM الكامل الجديد. بعد 65 ساعة ، حصاد الطافد عن طريق الطرد المركزي.
جمع طافي وقسمة عليه. للكشف عن تعبير بروتين الهيماجلوتينين ، أضف 50 ميكرولترا من PBS إلى الأعمدة من الثاني إلى 12 من صفيحة سفلية مستديرة جيدا 96. أضف 100 ميكرولتر من الفيروس الزائف إلى آبار العمود الأول.
ثم انقل 50 ميكرولترا من الفيروس الزائف من العمود الأول إلى آبار العمود الثاني. قم بإجراء هذا التخفيف المزدوج حتى العمود 11 متبوعا بالخلط اللطيف. ثم تخلص من 50 ميكرولترا إضافيا من العمود 11.
أضف 50 ميكرولتر من 0.5٪ كريات الدم الحمراء في كل بئر متبوعا بخلط لطيف. بعد 30 إلى 60 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، راقب وسجل عيار هيماجلوتينين للفيروس الزائف. لمعايرة الفيروس الزائف ، قم بعمل تعليق خلية واحدة من خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الرابعة لكل ملليلتر من خلايا MDCK في وسط DMEM كامل.
أضف 1،250 و 2 و 500 و 5،000 و 10،000 و 20،000 و 40،000 خلية إلى آبار مختلفة من صفيحة بئر مسطحة القاع 96. بعد الحضانة ، ذوبان الجليد ودوامة الفيروس الزائف. أضف ستة HAU من الفيروسات الزائفة إلى كل بئر من صفيحة سفلية مستديرة 96 جيدا وقم بتجديد كل بئر ب DMEM الكامل حتى 120 ميكرولتر.
نقل 100 ميكرولتر من الخليط إلى الخلايا في لوحة البئر 96. احتضان لوحة الثقافة لمدة 48 و 60 و 72 ساعة للعدوى الفيروسية وإجراء فحص لوسيفيراز. لإجراء فحص luciferase ، اغسل الخلايا عن طريق إزالة الوسط بعناية وشطفه ب 200 ميكرولتر من PBS.
قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS ، ثم أضف 50 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى كل بئر. في اليوم التالي ، قم بموازنة الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، ثم هز ألواح الاستزراع عدة مرات وانقل جميع الخلايا المحللة إلى 96 لوحة بئر غير شفافة. أضف 50 ميكرولترا من الركيزة إلى كل لوحة واخلطها جيدا.
سجل عيار لوسيفيراز للفيروس الزائف باستخدام مقياس الإضاءة. أضف 100 ميكرولتر من معلق الخلية الواحدة لخلايا MDCK إلى كل بئر من صفيحة بئر مسطحة القاع 96 واحتضانها لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، ذوبان الجليد ودوامة الفيروس الزائف والأمصال المخزنة في ناقص 80 درجة مئوية.
تمييع الأمصال 20 مرة في وسط كامل. أضف 100 ميكرولتر من وسط DMEM إلى الأعمدة من الثالث إلى 10. أضف 200 ميكرولتر من الأمصال المخففة إلى آبار العمود الثاني وقم بإجراء التخفيف التسلسلي.
ثم أضف 100 ميكرولتر من وسط DMEM إلى العمود 11 كعنصر تحكم سلبي. أضف 100 ميكرولتر من الفيروسات الزائفة إلى كل بئر واخلطها. انقل 100 ميكرولتر من الخليط من الصفيحة السفلية المستديرة 96 جيدا إلى البئر المقابلة للوحة زراعة خلايا البئر 96.
بعد 60 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، قم بإجراء فحص لوسيفيراز. أظهر فحص الهيماجلوتينين أن 643 وحدة HA لكل ملليلتر من فيروسات الأنفلونزا الزائفة موجودة في مخزونات فيروسات الأنفلونزا الزائفة. كانت نسب HA و Gag P24 ضمن النطاق الطبيعي.
أظهر فحص اللطخة الغربية وجود أربعة أنواع من البروتين ، بما في ذلك بروتينات HA0 و HA1 و HA2 و NA ، مما يشير إلى تشابه فيروسات الأنفلونزا الزائفة مع فيروسات النوع البري. تشير نتائج معايرة الفيروس الزائف إلى أن الظروف المناسبة لأعلى نشاط نسبي لوسيفيراز تشمل تغذية 5000 خلية في بئر من 96 صفيحة بئر واكتشاف قراءات نشاط لوسيفيراز النسبية بعد 60 ساعة من الإصابة بالفيروس. أظهرت الأمصال المناعية من مجموعة DDV عيارات تحييد عالية ضد سلالة الفيروس الزائف A Thailand 1 Can 104 ، في حين لم تظهر الأمصال من المجموعة الضابطة أي نشاط تحييد.
كان النشاط المعادل للأمصال المناعية قويا مقارنة بأمصال التحكم ، مما يشير إلى أن الكثير من الأجسام المضادة تم توجيهها إلى رأس HA في الأمصال المناعية. تشير الاختلافات الكبيرة بين الأمصال المناعية والضوابط أثناء تقييم الدخول الفيروسي إلى أن الأجسام المضادة موجهة إلى منطقة جذع HA في الأمصال المناعية. عند تنفيذ هذا الإجراء ، تذكر الحفاظ على درجة الحموضة في محلول النقل ووسط الثقافة مستقرة.
