Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren und die kritischen Schritte von H5-Präparaten für Vogelgrippe mit hohem Krankheitserregergehalt und Pseudovirus-Neutralisationsassays. Außerdem werden die Einschränkungen bei der Fehlerbehebung und die Modifikationen dieser Assays erörtert. Hochpathogene Krankheitserreger müssen im Biosicherheitslabor der Stufe drei durchgeführt werden, während Pseudoviren in einem Biosicherheitslabor der Stufe zwei sicher gehandhabt werden können.
Stellen Sie zunächst eine Einzelzellsuspension von HEK293 FT-Zellen in einem vollständigen DMEM-Medium her. 10 Milliliter der einzelligen Suspension in einen T75-Kolben geben, anschließend bei 37 Grad Celsius inkubieren. Ersetzen Sie zwei Stunden vor der Transfektion das alte Medium durch 10 Milliliter frisches Komplettmedium mit Chloroquin.
Mischen Sie die Reagenzien und die Plasmid-DNA wie im Manuskript beschrieben, übertragen Sie diese Mischung dann in das Medium über den Zellen und rocken Sie sie vorsichtig. Ersetzen Sie das Medium nach der Inkubation durch 15 Milliliter frisches, vollständiges DMEM-Medium. Nach 65 Stunden wird der Überstand durch Zentrifugieren geerntet.
Sammeln Sie den Überstand und aliquotieren Sie ihn. Um die Expression des Hämagglutinin-Proteins nachzuweisen, geben Sie 50 Mikroliter PBS in die Säulen zwei bis 12 einer runden Bodenplatte mit 96 Wells. Geben Sie 100 Mikroliter Pseudovirus in die Vertiefungen der ersten Säule.
Übertragen Sie dann 50 Mikroliter Pseudovirus aus der ersten Säule in die Vertiefungen der zweiten Säule. Führen Sie diese zweifache Verdünnung bis zur Säule 11 durch, gefolgt von einer sanften Vermischung. Entsorgen Sie dann die zusätzlichen 50 Mikroliter aus Spalte 11.
Geben Sie 50 Mikroliter 0,5%ige Erythrozyten in jede Vertiefung und mischen Sie sie anschließend vorsichtig. Nach 30 bis 60 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur werden die Hämagglutinintiter des Pseudovirus beobachtet und aufgezeichnet. Für die Pseudovirus-Titration wird eine Einzelzellsuspension von fünfmal 10 bis vier Zellen pro Milliliter MDCK-Zellen in einem vollständigen DMEM-Medium hergestellt.
Fügen Sie 1, 250, 2, 500, 5, 000, 10, 000, 20, 000 und 40.000 Zellen zu verschiedenen Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit flachem Boden hinzu. Tauen Sie das Pseudovirus nach der Inkubation auf und wirbeln Sie es vor. Geben Sie sechs HAU von Pseudoviren in jede Vertiefung einer runden 96-Well-Bodenplatte und füllen Sie jede Vertiefung mit vollständigem DMEM bis zu 120 Mikrolitern auf.
Übertragen Sie 100 Mikroliter der Mischung auf die Zellen in der 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Kulturplatte 48, 60 und 72 Stunden lang für eine Virusinfektion und führen Sie einen Luciferase-Assay durch. Um den Luciferase-Assay durchzuführen, waschen Sie die Zellen, indem Sie das Medium vorsichtig entfernen und mit 200 Mikrolitern PBS spülen.
Entfernen Sie so viel PBS wie möglich und geben Sie dann 50 Milliliter des Lysepuffers in jede Vertiefung. Am nächsten Tag werden die Platten zwei Stunden lang bei Raumtemperatur äquilibriert, dann die Kulturplatten mehrmals geschaukelt und alle Zelllysate auf undurchsichtige 96-Well-Platten überführt. Geben Sie 50 Mikroliter des Substrats auf jede Platte und mischen Sie es gut.
Zeichnen Sie die Luciferase-Titer des Pseudovirus mit dem Luminometer auf. Geben Sie 100 Mikroliter der Einzelzellsuspension von MDCK-Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden und inkubieren Sie sie 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation das Pseudovirus und die bei minus 80 Grad Celsius gelagerten Seren auftauen und wirbeln.
Verdünnen Sie die Seren 20-mal in einem vollständigen Medium. Geben Sie 100 Mikroliter DMEM-Medium in die Spalten drei bis 10. Geben Sie 200 Mikroliter der verdünnten Seren in die Vertiefungen der zweiten Säule und führen Sie eine serielle Verdünnung durch.
Geben Sie dann 100 Mikroliter DMEM-Medium als Negativkontrolle in die 11. Spalte. Geben Sie 100 Mikroliter Pseudoviren in jede Vertiefung und mischen Sie sie. Übertragen Sie 100 Mikroliter des Gemisches von der runden 96-Well-Bodenplatte in die entsprechende Vertiefung der 96-Well-Zellkulturplatte.
Führen Sie nach 60 Stunden Inkubation bei 37 Grad Celsius den Luciferase-Assay durch. Der Hämagglutinin-Assay zeigte, dass 643 HA-Einheiten pro Milliliter Influenza-Pseudoviren in Influenza-Pseudovirus-Beständen vorhanden sind. Die Verhältnisse von HA und Knebel P24 lagen im Normbereich.
Der Western-Blot-Assay zeigte das Vorhandensein von vier Proteintypen, darunter HA0-, HA1-, HA2- und NA-Proteine, was auf die Ähnlichkeit von Influenza-Pseudoviren mit denen von Wildtyp-Viren hinweist. Die Ergebnisse der Pseudovirus-Titration deuten darauf hin, dass die geeigneten Bedingungen für die höchste relative Luciferase-Aktivität die Fütterung von 5.000 Zellen in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte und die Detektion relativer Luciferase-Aktivitätswerte nach 60 Stunden Virusinfektion umfassen. Die Immunseren der DDV-Gruppe zeigten hohe Neutralisationstiter gegen den Stamm des Pseudovirus A Thailand 1 Can 104, während die Seren der Kontrollgruppe keine Neutralisationsaktivität aufwiesen.
Die neutralisierende Aktivität der Immunseren war im Vergleich zu den Kontrollseren stark, was darauf hindeutet, dass in den Immunseren viele Antikörper gegen den HA-Kopf gerichtet waren. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Immunseren und den Kontrollen bei der Beurteilung des Viruseintritts deuten darauf hin, dass die Antikörper in den Immunseren auf die HA-Stammregion gerichtet sind. Denken Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens daran, den pH-Wert der Transfektionslösung und des Nährmediums stabil zu halten.
