Questo protocollo descrive le procedure e le fasi critiche dei preparativi di pseudovirus dell'influenza aviaria ad alta patogenicità H5 e dei saggi di neutralizzazione degli pseudo virus. Inoltre, discute la limitazione della risoluzione dei problemi e le modifiche di questi test. Gli agenti patogeni altamente patogeni devono essere effettuati nel laboratorio di biosicurezza di livello tre, mentre gli pseudo virus possono essere gestiti in modo sicuro in un laboratorio di biosicurezza di livello due.
Per iniziare, effettuare una sospensione a cella singola di celle HEK293 FT in un mezzo DMEM completo. Aggiungere 10 millilitri della sospensione a cella singola in un pallone T75, seguito dall'incubazione a 37 gradi Celsius. Due ore prima della trasfezione, sostituire il vecchio mezzo con 10 millilitri di mezzo completo fresco con clorochina.
Mescolare i reagenti e il DNA plasmidico come descritto nel manoscritto, quindi trasferire questa miscela nel mezzo sopra le cellule e oscillare delicatamente. Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo con 15 millilitri di mezzo DMEM completo fresco. Dopo 65 ore, raccogliere il surnatante mediante centrifugazione.
Raccogli il surnatante e aliquotalo. Per rilevare l'espressione proteica dell'emoagglutinina, aggiungere 50 microlitri di PBS nelle colonne da due a 12 di una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti. Aggiungere 100 microlitri di pseudo virus nei pozzetti della colonna uno.
Quindi trasferire 50 microlitri di pseudo virus dalla colonna uno nei pozzetti della colonna due. Eseguire questa doppia diluizione fino alla colonna 11 seguita da una miscelazione delicata. Quindi scartare i 50 microlitri in più dalla colonna 11.
Aggiungere 50 microlitri di eritrociti allo 0,5% in ciascun pozzetto seguito da una miscelazione delicata. Dopo 30-60 minuti di incubazione a temperatura ambiente, osservare e registrare i titoli di emoagglutinina dello pseudo virus. Per la titolazione pseudo del virus, effettuare una sospensione singola cellulare di cinque volte 10 alla quarta cellula per millilitro di cellule MDCK in un mezzo DMEM completo.
Aggiungi 1, 250, 2, 500, 5, 000, 10, 000, 20, 000 e 40.000 celle a diversi pozzetti di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Dopo l'incubazione, scongelare e vortice lo pseudo virus. Aggiungi sei HAU di pseudo virus a ciascun pozzetto di una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti e riempi ogni pozzetto con DMEM completo fino a 120 microlitri.
Trasferire 100 microlitri della miscela alle celle nella piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra di coltura per 48, 60 e 72 ore per l'infezione virale ed eseguire un test della luciferasi. Per eseguire il test della luciferasi, lavare le cellule rimuovendo accuratamente il mezzo e risciacquandolo con 200 microlitri di PBS.
Rimuovere il più possibile il PBS, quindi aggiungere 50 millilitri di tampone di lisi a ciascun pozzetto. Il giorno successivo, equilibrare le piastre a temperatura ambiente per due ore, quindi scuotere più volte le piastre di coltura e trasferire tutti i lisati cellulari in piastre opache a 96 pozzetti. Aggiungere 50 microlitri di substrato a ciascuna piastra e mescolare bene.
Registrare i titoli luciferasi dello pseudo virus utilizzando il luminometro. Aggiungere 100 microlitri della sospensione a singola cella di cellule MDCK a ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto 96 pozzetti e incubarlo per 20 ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, scongelare e vortice lo pseudo virus e i sieri conservati a meno 80 gradi Celsius.
Diluire i sieri 20 volte in un mezzo completo. Aggiungere 100 microlitri di mezzo DMEM alle colonne da tre a 10. Aggiungere 200 microlitri di sieri diluiti nei pozzetti della seconda colonna ed eseguire la diluizione seriale.
Quindi aggiungere 100 microlitri di mezzo DMEM all'11a colonna come controllo negativo. Aggiungere 100 microlitri di pseudo virus a ciascun pozzetto e mescolare. Trasferire 100 microlitri della miscela dalla piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti al pozzetto corrispondente della piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti.
Dopo 60 ore di incubazione a 37 gradi Celsius, eseguire il test della luciferasi. Il test dell'emoagglutinina ha mostrato che 643 unità HA per millilitro di pseudo virus influenzali sono presenti nelle scorte di pseudo virus dell'influenza. I rapporti di HA e Gag P24 erano all'interno di un intervallo normale.
Il test western blot ha mostrato la presenza di quattro tipi di proteine, tra cui le proteine HA0, HA1, HA2 e NA, indicando la somiglianza degli pseudo virus influenzali con quelli dei virus wild type. I risultati della titolazione pseudo virus indicano che le condizioni adatte per la più alta attività relativa della luciferasi includono l'alimentazione di 5.000 cellule in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e il rilevamento delle letture relative dell'attività luciferasica dopo 60 ore di infezione virale. I sieri immunitari del gruppo DDV hanno mostrato titoli di neutralizzazione elevati contro lo pseudo virus A Thailand 1 Can 104 ceppo, mentre i sieri del gruppo di controllo non hanno mostrato alcuna attività di neutralizzazione.
L'attività neutralizzante dei sieri immunitari era potente rispetto ai sieri di controllo, indicando che molti anticorpi erano diretti alla testa HA nei sieri immuni. Le differenze significative tra i sieri immunitari e i controlli durante la valutazione dell'ingresso virale indicano che gli anticorpi sono diretti alla regione staminale HA nei sieri immunitari. Quando si esegue questa procedura, ricordarsi di mantenere stabile il pH della soluzione di trasfezione e il terreno di coltura.
