Bu protokol, H5 yüksek patojen kuş gribi psödovirüs preparatları ve psödovirüs nötralizasyon testlerinin prosedürlerini ve kritik adımlarını açıklamaktadır. Ayrıca, bu testlerin sorun giderme sınırlamalarını ve değişikliklerini tartışmaktadır. Yüksek derecede patojenik patojenler üçüncü seviye biyogüvenlik laboratuvarında gerçekleştirilmelidir, oysa sahte virüsler ikinci seviye biyogüvenlik laboratuvarında güvenle ele alınabilir.
Başlamak için, tam bir DMEM ortamında HEK293 FT hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonunu yapın. Bir T75 şişesine 10 mililitre tek hücreli süspansiyon ekleyin, ardından 37 santigrat derecede inkübasyon yapın. Transfeksiyondan iki saat önce, eski ortamı klorokin ile 10 mililitre taze tam ortam ile değiştirin.
Reaktifleri ve plazmid DNA'sını makalede açıklandığı gibi karıştırın, ardından bu karışımı hücrelerin üzerindeki ortama aktarın ve yavaşça sallayın. İnkübasyondan sonra, ortamı 15 mililitre taze tam DMEM ortamı ile değiştirin. 65 saat sonra, süpernatantı santrifüjleme ile hasat edin.
Supernatant'ı toplayın ve aliquot. Hemaglutinin protein ekspresyonunu tespit etmek için, 96 kuyucuklu yuvarlak bir alt plakanın iki ila 12 arasındaki sütunlarına 50 mikrolitre PBS ekleyin. Birinci sütunun kuyucuklarına 100 mikrolitre sahte virüs ekleyin.
Ardından, 50 mikrolitre sahte virüsü birinci sütundan ikinci sütunun kuyucuklarına aktarın. Bu iki katlı seyreltmeyi sütun 11'e kadar gerçekleştirin ve ardından nazik bir karıştırma yapın. Ardından ekstra 50 mikrolitreyi sütun 11'den atın.
Her bir oyuğa 50 mikrolitre% 0.5 eritrosit ekleyin ve ardından nazik bir şekilde karıştırın. Oda sıcaklığında 30 ila 60 dakikalık inkübasyondan sonra, sahte virüsün hemaglutinin titrelerini gözlemleyin ve kaydedin. Psödovirüs titrasyonu için, tam bir DMEM ortamında MDCK hücrelerinin mililitresi başına beş kez 10 ila dördüncü hücrenin beş katı tek bir hücre süspansiyonu yapın.
Düz tabanlı 96 kuyucuk plakasının farklı kuyucuklarına 1, 250, 2, 500, 5, 000, 10, 000, 20.000 ve 40.000 hücre ekleyin. Kuluçkadan sonra, sahte virüsü çözün ve vorteks. 96 kuyucuklu yuvarlak bir alt plakanın her bir kuyucuğuna altı HAU sahte virüs ekleyin ve her bir kuyucuğu 120 mikrolitreye kadar tam DMEM ile doldurun.
Karışımın 100 mikrolitresini 96 kuyucuk plakasındaki hücrelere aktarın. Kültür plakasını viral enfeksiyon için 48, 60 ve 72 saat boyunca inkübe edin ve bir lusiferaz testi yapın. Lusiferaz testini gerçekleştirmek için, ortamı dikkatlice çıkararak ve 200 mikrolitre PBS ile durulayarak hücreleri yıkayın.
PBS'nin mümkün olduğunca fazlasını çıkarın, ardından her bir kuyucuğa 50 mililitre lizis tamponu ekleyin. Ertesi gün, plakaları iki saat boyunca oda sıcaklığında dengeleyin, ardından kültür plakalarını birkaç kez sallayın ve tüm hücre lizatlarını opak 96 kuyucuk plakalarına aktarın. Her plakaya 50 mikrolitre substrat ekleyin ve iyice karıştırın.
Luminometreyi kullanarak sahte virüsün lusiferaz titrelerini kaydedin. Düz tabanlı 96 kuyucuk plakasının her bir kuyucuğuna MDCK hücrelerinin tek hücreli süspansiyonundan 100 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derecede 20 saat boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, sahte virüsü ve eksi 80 santigrat derecede depolanan serumları çözer ve vorteks.
Serumu tam bir ortamda 20 kez seyreltin. Üç ila 10 arasındaki sütunlara 100 mikrolitre DMEM ortamı ekleyin. İkinci sütunun kuyucuklarına seyreltilmiş serumun 200 mikrolitresini ekleyin ve seri seyreltme yapın.
Ardından, negatif kontrol olarak 11. sütuna 100 mikrolitre DMEM ortamı ekleyin. Her bir kuyucuğa 100 mikrolitre sahte virüs ekleyin ve karıştırın. Karışımın 100 mikrolitresini 96 kuyucuklu yuvarlak alt plakadan 96 kuyucuklu hücre kültürü plakasının karşılık gelen kuyucuğuna aktarın.
37 santigrat derecede 60 saatlik inkübasyondan sonra, lusiferaz testini yapın. Hemaglutinin testi, influenza psödo-virüs stoklarında mililitre başına 643 HA ünite influenza psödo-virüs bulunduğunu göstermiştir. HA ve Gag P24 oranları normal bir aralıktaydı.
Batı leke testi, influenza psödo-virüslerinin vahşi tip virüslerinkine benzerliğini gösteren HA0, HA1, HA2 ve NA proteinleri de dahil olmak üzere dört protein tipinin varlığını göstermiştir. Psödo-virüs titrasyon sonuçları, en yüksek bağıl lusiferaz aktivitesi için uygun koşulların, 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğunda 5.000 hücrenin beslenmesini ve 60 saatlik virüs enfeksiyonundan sonra bağıl lusiferaz aktivite okumalarının tespit edilmesini içerdiğini göstermektedir. DDV grubundan immün serumlar, sahte virüs A Tayland 1 Can 104 suşuna karşı yüksek nötralizasyon titreleri sergilerken, kontrol grubundaki serumlar herhangi bir nötralizasyon aktivitesi göstermedi.
İmmün serumların nötralize edici aktivitesi, kontrol serumlarına kıyasla güçlüydü, bu da immün serumdaki HA kafasına birçok antikorun yönlendirildiğini gösteriyordu. İmmün serumlar ile viral girişin değerlendirilmesi sırasındaki kontroller arasındaki anlamlı farklar, antikorların immün serumdaki HA kök bölgesine yönlendirildiğini göstermektedir. Bu prosedürü uygularken, transfeksiyon çözeltisinin pH'ını ve kültür ortamını sabit tutmayı unutmayın.
