פרוטוקול זה מתאר את ההליכים ואת השלבים הקריטיים של H5 פתוגן גבוה, שפעת העופות, תכשירי וירוס פסאודו ומבחני נטרול וירוסים מדומים. כמו כן, הוא דן במגבלת פתרון הבעיות ובשינויים של בדיקות אלה. פתוגנים פתוגניים מאוד חייבים להתבצע במעבדת בטיחות ביולוגית ברמה שלוש, בעוד שניתן לטפל בנגיפים מדומים בבטחה במעבדת בטיחות ביולוגית ברמה שתיים.
כדי להתחיל, בצע השעיה של תא יחיד של תאי HEK293 FT בתווך DMEM מלא. הוסף 10 מיליליטר של תרחיף התא הבודד לצלוחית T75, ולאחר מכן דגירה ב 37 מעלות צלזיוס. שעתיים לפני הטרנספקציה, להחליף את המדיום הישן עם 10 מיליליטר של מדיום שלם טרי עם כלורוקין.
מערבבים את הריאגנטים ואת הדנ"א של פלסמיד כמתואר בכתב היד, ואז מעבירים את התערובת לתווך שמעל התאים ומתנדנדים בעדינות. לאחר הדגירה, להחליף את המדיום עם 15 מיליליטר של מדיום DMEM שלם טרי. לאחר 65 שעות, קוצרים את הסופרנאטנט באמצעות צנטריפוגה.
לאסוף את supernatant ו aliquot אותו. כדי לזהות ביטוי חלבון המגלוטינין, הוסף 50 מיקרוליטר של PBS לעמודות שתיים עד 12 של צלחת תחתונה עגולה היטב 96. הוסף 100 מיקרוליטר של וירוס מדומה לתוך הבארות של עמודה אחת.
לאחר מכן להעביר 50 מיקרוליטר של וירוס מדומה מעמודה אחת לתוך הבארות של עמודה שתיים. בצעו את הדילול הכפול עד לטור 11 ואחריו ערבוב עדין. לאחר מכן השליכו את 50 המיקרוליטרים הנוספים מעמודה 11.
הוסיפו 50 מיקרוליטר של 0.5% אריתרוציטים לכל באר ולאחר מכן ערבוב עדין. לאחר 30 עד 60 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, לצפות ולתעד titers hemagglutinin של וירוס pseudo. עבור טיטרציה וירוס מדומה, בצע השעיה של תא בודד של חמש פעמים 10 לתאים הרביעי למיליליטר של תאי MDCK בתווך DMEM שלם.
הוסף 1, 250, 2, 500, 5, 000, 10, 000, 20, 000, ו 40, 000 תאים לבארות שונות של צלחת 96 תחתית שטוחה. לאחר הדגירה, להפשיר ולערבל את וירוס פסאודו. הוסף שישה HAU של וירוסים מדומים לכל באר של צלחת תחתונה עגולה היטב 96 ולחדש כל באר עם DMEM מלא עד 120 מיקרוליטר.
מעבירים 100 מיקרוליטר מהתערובת לתאים בצלחת 96 הבאר. לדגור על צלחת התרבית במשך 48, 60, ו 72 שעות עבור זיהום ויראלי ולבצע בדיקת luciferase. כדי לבצע את הבדיקה luciferase, לשטוף את התאים על ידי הסרת המדיום בזהירות ולשטוף אותו עם 200 מיקרוליטר של PBS.
הסר כמה שיותר PBS ולאחר מכן הוסף 50 מיליליטר של חיץ הליזיס לכל באר. למחרת, אזנו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, ואז נענעו את צלחות התרבית מספר פעמים והעבירו את כל הליזטים של התא לצלחות אטומות של 96 בארות. מוסיפים 50 מיקרוליטר של המצע לכל צלחת ומערבבים היטב.
רשום את titers luciferase של וירוס pseudo באמצעות luminometer. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תא בודד של תאי MDCK לכל באר של צלחת 96 תחתית שטוחה ולדגור אותו במשך 20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, מפשירים ומערבלים את הנגיף המדומה ואת הסרה המאוחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס.
לדלל את sera 20 פעמים בתווך שלם. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום DMEM לעמודות שלוש עד 10. מוסיפים 200 מיקרוליטר של סרה מדוללת לבארות של הטור השני ולבצע דילול סדרתי.
לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום DMEM לעמודה ה -11 כבקרה השלילית. מוסיפים 100 מיקרוליטר של וירוסים מדומים לכל באר ומערבבים אותה. מעבירים 100 מיקרוליטר מהתערובת מהצלחת התחתונה העגולה היטב 96 לבאר המתאימה של צלחת תרבית התאים 96 באר.
לאחר 60 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, לבצע את הבדיקה luciferase. בדיקת hemagglutinin הראתה כי 643 יחידות HA למיליליטר של נגיפי פסאודו שפעת נמצאים במלאי וירוס פסאודו שפעת. היחסים של HA ו- Gag P24 היו בטווח הנורמלי.
בדיקת הכתם המערבי הראתה נוכחות של ארבעה סוגי חלבונים, כולל חלבוני HA0, HA1, HA2 ו-NA, מה שמצביע על הדמיון בין נגיפי פסאודו של שפעת לזה של וירוסים מסוג פראי. תוצאות טיטרציה של וירוס פסאודו מצביעות על כך שהתנאים המתאימים לפעילות הלוציפראז היחסית הגבוהה ביותר כוללים הזנה של 5, 000 תאים בבאר של צלחת באר 96 ואיתור קריאות פעילות לוציפראז יחסיות לאחר 60 שעות של הדבקה בנגיף. סרה חיסונית מקבוצת ה- DDV הציגה טיטרים מנטרלים גבוהים נגד נגיף מדומה A Thailand 1 Can 104, ואילו סרה מקבוצת הביקורת לא הציגה פעילות נטרול כלשהי.
הפעילות המנטרלת של סרה החיסון הייתה חזקה בהשוואה לסרה הביקורתית, מה שמצביע על כך שנוגדנים רבים הופנו לראש החומצה ההיאלורונית בסרה החיסונית. ההבדלים המשמעותיים בין סרה החיסון לבין קבוצת הביקורת במהלך הערכת הכניסה הנגיפית מצביעים על כך שהנוגדנים מופנים לאזור גזע החומצה ההיאלורונית בסרה. בעת ביצוע הליך זה, זכור לשמור על ה- pH של תמיסת הטרנספקציה ועל מדיום התרבית יציב.
