Este protocolo describe los procedimientos y los pasos críticos de las preparaciones de pseudovirus de la influenza aviar H5 de alto riesgo y los ensayos de neutralización del pseudovirus. Además, se discute la limitación de solución de problemas y las modificaciones de estos ensayos. Los patógenos altamente patógenos deben llevarse a cabo en el laboratorio de bioseguridad de nivel tres, mientras que los pseudovirus pueden manejarse de manera segura en un laboratorio de bioseguridad de nivel dos.
Para comenzar, haga una suspensión de una sola celda de células HEK293 FT en un medio DMEM completo. Añadir 10 mililitros de suspensión unicelular a un matraz T75, seguido de incubación a 37 grados centígrados. Dos horas antes de la transfección, reemplace el medio viejo con 10 mililitros de medio completo fresco con cloroquina.
Mezcle los reactivos y el ADN plásmido como se describe en el manuscrito y luego transfiera esta mezcla al medio por encima de las células y la roca suavemente. Después de la incubación, reemplace el medio con 15 mililitros de medio DMEM completo fresco. Después de 65 horas, cosechar el sobrenadante por centrifugación.
Recoger el sobrenadante y alícuota. Para detectar la expresión de la proteína hemaglutinina, agregue 50 microlitros de PBS en las columnas dos a 12 de una placa inferior redonda de 96 pocillos. Agregue 100 microlitros de pseudo virus en los pozos de la columna uno.
Luego transfiera 50 microlitros de pseudo virus de la columna uno a los pozos de la columna dos. Realice esta doble dilución hasta la columna 11 seguida de una mezcla suave. Luego deseche los 50 microlitros adicionales de la columna 11.
Agregue 50 microlitros de eritrocitos al 0,5% en cada pocillo seguido de una mezcla suave. Después de 30 a 60 minutos de incubación a temperatura ambiente, observe y registre los títulos de hemaglutinina del pseudovirus. Para la titulación del pseudovirus, haga una suspensión de una sola célula de cinco veces 10 a la cuarta células por mililitro de células MDCK en un medio DMEM completo.
Agregue 1, 250, 2, 500, 5, 000, 10, 000, 20, 000 y 40, 000 celdas a diferentes pocillos de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Después de la incubación, descongele y vortex el pseudo virus. Agregue seis HAU de pseudovirus a cada pocillo de una placa inferior redonda de 96 pocillos y reponga cada pocillo con DMEM completo de hasta 120 microlitros.
Transfiera 100 microlitros de la mezcla a las células en la placa de pocillos 96. Incubar la placa de cultivo durante 48, 60 y 72 horas para la infección viral y realizar un ensayo de luciferasa. Para realizar el ensayo de luciferasa, lave las células retirando el medio con cuidado y enjuagándolo con 200 microlitros de PBS.
Retire la mayor cantidad posible de PBS, luego agregue 50 mililitros del tampón de lisis a cada pozo. Al día siguiente, equilibre las placas a temperatura ambiente durante dos horas, luego balancee las placas de cultivo varias veces y transfiera todos los lisados celulares a placas opacas de 96 pocillos. Añadir 50 microlitros del sustrato a cada plato y mezclar bien.
Registre los títulos de luciferasa del pseudovirus usando el luminómetro. Agregue 100 microlitros de la suspensión de células de MDCK a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos e incube durante 20 horas a 37 grados centígrados. Después de la incubación, descongele y vórtice el pseudo virus y los sueros almacenados a menos 80 grados centígrados.
Diluir los sueros 20 veces en un medio completo. Agregue 100 microlitros de medio DMEM a las columnas de tres a 10. Agregue 200 microlitros de sueros diluidos en los pocillos de la segunda columna y realice la dilución en serie.
Luego agregue 100 microlitros de medio DMEM a la columna 11 como control negativo. Agregue 100 microlitros de pseudovirus a cada pocillo y mézclelo. Transfiera 100 microlitros de la mezcla de la placa inferior redonda de 96 pocillos al pocillo correspondiente de la placa de cultivo celular de 96 pocillos.
Después de 60 horas de incubación a 37 grados centígrados, realice el ensayo de luciferasa. El ensayo de hemaglutinina mostró que 643 unidades de HA por mililitro de pseudovirus de influenza están presentes en las existencias de pseudovirus de influenza. Las proporciones de HA y Gag P24 estaban dentro de un rango normal.
El ensayo Western blot mostró la presencia de cuatro tipos de proteínas, incluidas las proteínas HA0, HA1, HA2 y NA, lo que indica la similitud de los pseudovirus de la influenza con los virus de tipo salvaje. Los resultados de la titulación del pseudovirus indican que las condiciones adecuadas para la mayor actividad relativa de luciferasa incluyen la alimentación de 5.000 células en un pocillo de una placa de 96 pocillos y la detección de lecturas relativas de actividad de luciferasa después de 60 horas de infección por virus. Los sueros inmunes del grupo DDV exhibieron altos títulos de neutralización contra la cepa Can 104 del pseudovirus A Tailandia 1, mientras que los sueros del grupo control no exhibieron ninguna actividad de neutralización.
La actividad neutralizante de los sueros inmunes fue potente en comparación con los sueros de control, lo que indica que muchos anticuerpos se dirigieron a la cabeza de HA en los sueros inmunes. Las diferencias significativas entre los sueros inmunes y los controles durante la evaluación de la entrada viral indican que los anticuerpos se dirigen a la región madre HA en el suero inmune. Al realizar este procedimiento, recuerde mantener estable el pH de la solución de transfección y el medio de cultivo.
