В этом протоколе описываются процедуры и критические этапы псевдовирусных препаратов птичьего гриппа H5 с высоким патогеном и анализов псевдовирусной нейтрализации. Кроме того, в нем обсуждаются ограничения по устранению неполадок и модификации этих анализов. Высокопатогенные патогены должны проводиться в лаборатории биобезопасности третьего уровня, тогда как с псевдовирусами можно безопасно обращаться в лаборатории биобезопасности второго уровня.
Для начала сделайте одноклеточную суспензию ячеек HEK293 FT в полной среде DMEM. Добавьте 10 миллилитров одноклеточной суспензии в колбу T75 с последующей инкубацией при 37 градусах Цельсия. За два часа до трансфекции замените старую среду на 10 миллилитров свежей полной среды с хлорохином.
Смешайте реагенты и плазмидную ДНК, как описано в рукописи, затем перенесите эту смесь в среду над клетками и осторожно покачивайте. После инкубации замените среду 15 миллилитрами свежей полной среды DMEM. Через 65 часов соберите надосадочную жидкость центрифугированием.
Соберите надосадочную жидкость и аликвотируйте ее. Чтобы обнаружить экспрессию белка гемагглютинина, добавьте 50 микролитров PBS в столбцы со второго по 12 96-луночной круглой нижней пластины. Добавьте 100 микролитров псевдовируса в лунки первой колонки.
Затем переносят 50 микролитров псевдовируса из первой колонки в лунки второй колонки. Выполняйте это двукратное разбавление до столбца 11 с последующим аккуратным перемешиванием. Затем выбросьте лишние 50 микролитров из графы 11.
Добавьте 50 микролитров 0,5% эритроцитов в каждую лунку с последующим аккуратным перемешиванием. После 30-60 минут инкубации при комнатной температуре наблюдают и регистрируют титры гемагглютинина псевдовируса. Для титрования псевдовирусов сделайте одноклеточную суспензию в количестве от пяти до 10 четвертых клеток на миллилитр клеток MDCK в полной среде DMEM.
Добавьте 1 250, 2 500, 5 000, 10 000, 20 000 и 40 000 ячеек в разные лунки плиты с плоским дном 96. После инкубации оттаивают и встряхивают псевдовирус. Добавьте шесть HAU псевдовирусов в каждую лунку 96-луночной круглой нижней пластины и заполните каждую лунку полным DMEM до 120 микролитров.
Передайте 100 микролитров смеси в ячейки в 96-луночной пластине. Инкубируйте культуральную пластину в течение 48, 60 и 72 часов на вирусную инфекцию и проведите анализ люциферазы. Чтобы выполнить анализ люциферазы, промойте клетки, осторожно удалив среду и промыв ее 200 микролитрами PBS.
Удалите как можно больше PBS, затем добавьте 50 миллилитров буфера лизиса в каждую лунку. На следующий день уравновесьте пластины при комнатной температуре в течение двух часов, затем несколько раз перекачайте культуральные пластины и перенесите все лизаты клеток в непрозрачные 96 луночных пластин. Добавьте в каждую тарелку по 50 микролитров субстрата и хорошо перемешайте.
Запишите титры люциферазы псевдовируса с помощью люминометра. Добавьте 100 микролитров одноклеточной суспензии клеток MDCK в каждую лунку 96-луночной пластины с плоским дном и инкубируйте ее в течение 20 часов при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации оттаивают и перемешивают псевдовирус и сыворотки, хранящиеся при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Разбавьте сыворотку в 20 раз в полном средстве. Добавьте 100 микролитров среды DMEM в столбцы с третьего по 10. В лунки второй колонны добавляют 200 микролитров разбавленных сывороток и выполняют серийное разведение.
Затем добавьте 100 микролитров среды DMEM в 11-ю колонку в качестве отрицательного контроля. Добавьте в каждую лунку по 100 микролитров псевдовирусов и перемешайте. Перенесите 100 микролитров смеси из 96-луночной круглой нижней пластины в соответствующую лунку 96-луночной клеточной культуральной пластины.
После 60 часов инкубации при 37 градусах Цельсия проведите анализ люциферазы. Анализ гемагглютинина показал, что в запасах псевдовирусов гриппа присутствует 643 единицы ГК на миллилитр псевдовирусов гриппа. Соотношения HA и Gag P24 были в пределах нормы.
Анализ вестерн-блоттинга показал наличие четырех типов белков, включая белки HA0, HA1, HA2 и NA, что указывает на сходство псевдовирусов гриппа с вирусами дикого типа. Результаты псевдовирусного титрования показывают, что подходящие условия для наивысшей относительной активности люциферазы включают кормление 5 000 клеток в лунке 96-луночной пластины и обнаружение показаний относительной активности люциферазы через 60 часов после заражения вирусом. Иммунные сыворотки из группы DDV показали высокие титры нейтрализации против штамма псевдовируса A Thailand 1 Can 104, тогда как сыворотки из контрольной группы не проявляли никакой нейтрализующей активности.
Нейтрализующая активность иммунных сывороток была мощной по сравнению с контрольной сывороткой, что указывает на то, что в иммунных сыворотках на головку ГК было направлено много антител. Значимые различия между иммунными сыворотками и контрольной группой при оценке проникновения вируса указывают на то, что антитела направляются в стволовую область HA в иммунных сыворотках. При выполнении этой процедуры не забывайте поддерживать стабильный рН раствора для трансфекции и питательной среды.
