このプロトコルに記載されている方法は、心臓リプログラミング研究のためのICMの機能的成熟を評価するための貴重なプラットフォームを提供する。カルシウムフラックスは、Iccmで排他的に観察され、ICM機能成熟を評価する方法を提供します。このマウスのひずみは評価手順を簡素化し、結果の再現性を高めます。
このプロトコルは、心臓リプログラミング分野におけるICMの機能成熟を評価する新しい方法です。また、心筋細胞分化および心機能を評価するために適用することができる。1,000万匹の新生児心臓線維芽細胞(NCF)を単離するために8〜10匹の子犬、P0〜P2子犬を得ることによって始まります。
低体温によって子犬を深く麻酔します。蛍光顕微鏡下で心臓を観察し、所望の遺伝子型を持つ心臓がカルシウムフラックスを示すことを確認し、GCaMP3が心臓を鼓動させる。他の遺伝子型は蛍光を示さない。
心臓を分離した後、彼らは緩く接続されているように4つの部分にそれらをカットします。氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を6センチメートルのプレートで数回徹底的に洗い、単離された細胞の血球汚染を制限します。8ミリリットルの暖かい0.25%トリプシン-EDTAを摂氏37度で10分間消化します。
トリプシン上清を捨て、ハンクのバランスのとれた塩溶液に1ミリリットルの暖かいタイプ2コラゲナーゼあたり0.5ミリグラムの5ミリリットルを加えます。混合物を徹底的に渦し、摂氏37度で5分間インキュベートした。インキュベーションの後、再び、混合物を徹底的に渦し、未消化の組織を重力によって落ち着かせる。
冷たい線維芽細胞培地の5ミリリットルで15ミリリットルの円錐状のチューブに上清を集めます。播種密度が1立方センチメートル当たり4番目の細胞の2〜2.5倍になるように、線維芽細胞培地で細胞を希釈します。その後、皿や皿に細胞を播種します。
付属の線維芽細胞は、播種後2日目に円形に楕円形を持っている必要があります。ゼロ日目に、繊維芽細胞培地でNCFを1〜2倍から立方センチメートル当たり4番目の細胞の密度にシードします。1日目には、必要に応じて各々のウイルス含有培地を培地に置換する。
2日目、ウイルス感染後24時間、ウイルス含有培地を通常のICM培地に置き換える。蛍光反転顕微鏡でカルシウムイオンフラックスを室温で評価します。GCaMP3陽性細胞を10Xの目標下で観察し、明視野チャネルで拍動する自発的な細胞を示すようにする。
正しい遺伝子型を有する心臓は、カルシウムイオンフラックスが拍動と同期し、GCaMP3の蛍光として視覚化された。コントロール心臓では蛍光は認められなかった。2時間以内にウェルに取り付けられた孤立したNCFは、播種の1日後に円形に楕円形を示した。
カルシウムイオン振動は、GCaMP3の蛍光変化を示し、その細胞の最大と最小とカルシウムイオン振動が周期的に変化した。IMAPを導入した後、高出力分野に対するカルシウムイオン束を有するGCaMP3陽性細胞の数がIMAP中処理群で増加したため、打ち負かすクラスターの数は制御群のそれよりも有意に多かった。NCFは、孤立後に新たに準備され、健康でなければなりません。
心臓の分離、切断、および適切な消化時間の迅速な手順は、細胞の生存率と状態の低下を避けるのに役立ちます。この方法は、心臓リプログラミング研究者のための機能的な交配されたIcMを同定する方法を提供する。さらに複数の評価方法を使用すると、機能的な交配ICCMについてより簡潔な理解を得ることができます。
