Методы, описанные в этом протоколе, обеспечат ценную платформу для оценки функционального созревания МСМ для исследований сердечного перепрограммирования. Поток кальция наблюдается исключительно в МСМ и обеспечивает способ оценки функционального созревания ICM. Этот штамм мыши упрощает процедуры оценки и повышает воспроизводимость результатов.
Этот протокол является новым методом оценки функционального созревания МСМ в области перепрограммирования сердца. Он также может быть применен для оценки дифференцировки кардиомиоцитов и сердечной функции. Начните с получения от восьми до 10 детенышей, от P0 до P2, чтобы изолировать 10 миллионов неонатальных сердечных фибробластов или NCF.
Глубоко обезболивают детенышей путем переохлаждения. Наблюдайте за сердцами под флуоресцентным микроскопом, чтобы убедиться, что сердце с нужным генотипом показывает поток кальция, обозначенный GCaMP3 с бьющимися сердцами. Другие генотипы не будут проявлять флуоресценцию.
После изоляции сердец разрежьте их на четыре части, чтобы они были слабо связаны. Тщательно промойте их несколько раз в ледяном фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco, или DPBS, в шестисантиметровой пластине, чтобы ограничить загрязнение клеток крови в изолированных клетках. Переваривайте сердца восемью миллилитрами теплого 0,25%трипсина-ЭДТА в 37 градусах Цельсия в течение 10 минут.
Откажитесь от супернатанта трипсина и добавьте пять миллилитров по 0,5 миллиграмма на миллилитр теплой коллагеназы второго типа в сбалансированный солевой раствор Хэнка. Тщательно вихрьте смесь и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После инкубации снова тщательно вихрьте смесь и дайте непереваренной ткани осесть под действием силы тяжести.
Соберите супернатант в 15-миллилитровую коническую трубку с пятью миллилитрами холодной среды фибробластов. Разбавьте клетки средой фибробластов таким образом, чтобы плотность посева составляла от двух до 2,5 раз 10-четвертых клеток на кубический сантиметр. Затем посейте клетки в посуде или тарелках.
Прикрепленные фибробласты должны иметь овальную или круглую форму на второй день после посева. На нулевой день засейте NCF до плотности примерно от одного до двух раз от 10 до четвертой клетки на кубический сантиметр в среде фибробластов. В первый день замените культуральную среду вирусосодержащей средой для каждой скважины по желанию.
На 2-й день, через 24 часа после заражения вирусом, замените вируссодержащую среду обычной средой ICM. Оцените поток ионов кальция с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа при комнатной температуре. Наблюдайте за положительными клетками GCaMP3 под объективом 10X, гарантируя, что он показывает спонтанные клетки, бьющиеся в канале яркого поля.
Сердца с правильным генотипом показали поток ионов кальция, синхронизированный с биением, визуализированный как флуресценция GCaMP3. При этом флуоресценции в контрольных сердцах не наблюдалось. Изолированные НКФ прикреплялись к колодцу в течение двух часов и показывали овальную или круглую форму через день после посева.
Колебание ионов кальция показало изменение флуоресценции GCaMP3 между максимальным и минимальным, а колебания ионов кальция таких клеток периодически менялись. После введения IMAP количество бьющихся кластеров было значительно выше, чем в контролируемой группе, поскольку количество положительных клеток GCaMP3 с потоком ионов кальция для поля высокой мощности было увеличено в группе, обработанной средой IMAP. НПФ должны быть свежеприготовленными и здоровыми после изоляции.
Быстрая процедура изоляции сердца, разрезания и правильного времени пищеварения может помочь избежать снижения жизнеспособности и состояния клеток. Этот метод обеспечивает способ идентификации функциональных созревших МСМ для исследователей сердечного перепрограммирования. С помощью нескольких дополнительных методов оценки можно получить более краткое представление о функциональных созревших МСБ.
