שיטות המתוארות בפרוטוקול זה יספקו פלטפורמה חשובה להערכת ההבשלה התפקודית של ICMs למחקרי תכנות לב. שטף הסידן נצפה באופן בלעדי ב- ICMs ומספק דרך להעריך התבגרות תפקודית ICM. זן עכבר זה מפשט את הליכי ההערכה ומשפר את יכולת הרבייה של התוצאות.
פרוטוקול זה הוא שיטה חדשה להערכת ההבשלה התפקודית של ICMs בשדה תכנות מחדש של הלב. זה יכול להיות מיושם גם כדי להעריך בידול קרדיומיוצייט ותפקוד הלב. התחל על ידי השגת שמונה עד 10 גורים, P0 כדי P2 גורים לבודד 10 מיליון פיברובלסטים לב יילודים, או NCFs.
מרדים עמוק את הגורים על ידי היפותרמיה. שים לב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטיות כדי להבטיח כי הלב עם הגנוטיפ הרצוי מראה שטף סידן, המצוין על ידי GCaMP3 עם פעימות הלבבות. הגנוטיפים האחרים לא יראו פלואורסצנטיות.
לאחר בידוד הלבבות, לחתוך אותם לארבע חתיכות כך שהם מחוברים באופן רופף. לשטוף אותם ביסודיות מספר פעמים בקור קרח של תמיסת מלח פוספט של דולבק, או DPBS, בצלחת שישה סנטימטרים כדי להגביל את זיהום תאי הדם בתאים המבודדים. לעכל את הלבבות עם שמונה מיליליטר של חם 0.25%טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
השליכו את הלטרפסין supernatant והוסיפו חמישה מיליליטר של 0.5 מיליגרם למיליליטר סוג חם שני קולגנאז בתמיסת המלח המאוזנת של האנק. מערבולת התערובת ביסודיות ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, שוב, מערבולת את התערובת ביסודיות ולתת את הרקמה מעוכל להתיישב על ידי כוח המשיכה.
לאסוף את supernatant בצינור חרוטי 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של בינוני פיברובלסט קר. לדלל את התאים עם מדיום פיברובלסט כך צפיפות הזריעה היא סביב 2 עד 2.5 פעמים 10 עד התא הרביעי לסנטימטר מעוקב. ואז לזרוע את התאים בכלים או צלחות.
הפיברובלסטים המצורפים צריכים להיות בצורת אליפסה עד עגולה ביום השני לאחר זריעה. ביום אפס, זרע את NCFs לצפיפות של סביב אחד עד שניים כפול 10 עד התא הרביעי לסנטימטר מעוקב במדיום פיברובלסט. ביום הראשון להחליף את המדיום התרבותי עם וירוס המכיל מדיום עבור כל טוב רצוי.
ביום 2, 24 שעות לאחר ההדבקה בנגיף, החלף את הנגיף המכיל בינוני עם בינוני ICM רגיל. להעריך את שטף יוני הסידן עם מיקרוסקופ פלואורסצנטיות הפוכה בטמפרטורת החדר. שים לב לתאים החיוביים GCaMP3 תחת המטרה 10X, להבטיח כי הוא מראה תאים ספונטניים פועמים בערוץ Brightfield.
לבבות עם הגנוטיפ הנכון הראו שטף יוני סידן מסונכרן עם פעימות, הדמו כמו קמח GCaMP3. בעוד שלא נצפתה פלואורסצנטיות בלב שליטה. NCFs מבודד מחובר לבאר בתוך שעתיים והראה צורה אליפטית לעגול יום אחד לאחר זריעה.
תנודות יוני הסידן הראו שינוי פלואורסצנטיות GCaMP3 בין המקסימום למינימום ותנודות יוני הסידן של תאים כאלה השתנו מעת לעת. לאחר הצגת IMAP, מספר אשכולות מכות היה גבוה משמעותית מזה בקבוצה המבוקרת כמו מספר תאים חיוביים GCaMP3 עם שטף יוני סידן עבור שדה כוח גבוה גדל בקבוצה טיפול בינוני IMAP. NCFs צריך להיות מוכן טרי ובריא לאחר הבידוד.
הליך מהיר של בידוד לב, חיתוך וזמן עיכול תקין יכול לעזור למנוע ירידה הכדאיות של התא ומצב. שיטה זו מספקת דרך לזהות ICMs רווי תפקודי לחוקרי תכנות מחדש של הלב. עם שיטות הערכה נוספות מרובות, ניתן לקבל הבנה תמציתית יותר לגבי ICMs רוויים פונקציונליים.
