Los métodos descritos en este protocolo proporcionarán una plataforma valiosa para evaluar la maduración funcional de los ICM para los estudios de reprogramación cardíaca. El flujo de calcio se observa exclusivamente en los ICM y proporciona una forma de evaluar la maduración funcional de la MCI. Esta cepa de ratón simplifica los procedimientos de evaluación y mejora la reproducibilidad de los resultados.
Este protocolo es un nuevo método para evaluar la maduración funcional de los ICM en el campo de la reprogramación cardíaca. También se puede aplicar para evaluar la diferenciación de cardiomiocitos y la función cardíaca. Comience por obtener de ocho a 10 cachorros, cachorros P0 a P2 para aislar 10 millones de fibroblastos cardíacos neonatales, o NCF.
Anestesiar profundamente a los cachorros por hipotermia. Observe los corazones bajo el microscopio de fluorescencia para asegurarse de que el corazón con el genotipo deseado muestre flujo de calcio, indicado por GCaMP3 con los corazones latiendo. Los otros genotipos no mostrarán fluorescencia.
Después del aislamiento de los corazones, córtelos en cuatro pedazos para que estén vagamente conectados. Lávelos bien varias veces en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco helada, o DPBS, en una placa de seis centímetros para limitar la contaminación de las células sanguíneas en las células aisladas. Digiera los corazones con ocho mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA caliente en 37 grados centígrados durante 10 minutos.
Deseche el sobrenadante de tripsina y agregue cinco mililitros de 0,5 miligramos por mililitro de colagenasa caliente tipo dos en la solución salina equilibrada de Hank. Vórtice la mezcla a fondo e incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, nuevamente, vórtice la mezcla a fondo y deje que el tejido no digerido se asiente por gravedad.
Recoger el sobrenadante en un tubo cónico de 15 mililitros con cinco mililitros de medio fibroblasto frío. Diluya las células con medio fibroblástico de tal manera que la densidad de siembra sea de dos a 2.5 veces 10 a la cuarta célula por centímetro cúbico. Luego siembra las células en platos o platos.
Los fibroblastos unidos deben tener una forma ovalada a redonda en el segundo día después de la siembra. En el día cero, sembra los NCF a la densidad de alrededor de una a dos veces 10 a la cuarta célula por centímetro cúbico en medio de fibroblastos. En el primer día, reemplace el medio de cultivo con un medio que contenga virus para cada pozo deseado.
El día 2, 24 horas después de la infección por el virus, reemplace el medio que contiene el virus con un medio ICM regular. Evalúe el flujo de iones de calcio con un microscopio de fluorescencia invertida a temperatura ambiente. Observe las células positivas GCaMP3 bajo el objetivo 10X, asegurándose de que muestra células espontáneas latiendo en el canal de campo brillante.
Los corazones con el genotipo correcto mostraron flujo de iones de calcio sincronizado con el latido, visualizado como fluorescencia GCaMP3. Mientras que no se observó fluorescencia en los corazones de control. Los NCF aislados se unieron al pozo en dos horas y mostraron una forma ovalada a redonda un día después de la siembra.
La oscilación de iones de calcio mostró un cambio de fluorescencia GCaMP3 entre el máximo y el mínimo y la oscilación de iones de calcio de tales células cambió periódicamente. Después de introducir IMAP, el número de grupos de latidos fue significativamente mayor que en el grupo controlado, ya que el número de células positivas GCaMP3 con flujo de iones de calcio para un campo de alta potencia aumentó en el grupo tratado con medio IMAP. Los NCF deben estar recién preparados y saludables después del aislamiento.
Un procedimiento rápido de aislamiento cardíaco, corte y tiempo de digestión adecuado puede ayudar a evitar la reducción de la viabilidad y la condición celular. Este método proporciona una forma de identificar ICM madurados funcionales para los investigadores de reprogramación cardíaca. Con múltiples métodos de evaluación adicionales, se puede obtener una comprensión más concisa sobre los ICM maduros funcionales.
