이 프로토콜에 설명된 방법은 심장 재프로그래밍 연구를 위한 ICM의 기능성숙을 평가하는 귀중한 플랫폼을 제공할 것입니다. 칼슘 플럭스는 ICM에서만 관찰되며 ICM 기능성 성숙도를 평가하는 방법을 제공합니다. 이 마우스 변형은 평가 절차를 단순화하고 결과의 재현성을 향상시킵니다.
이 프로토콜은 심장 재프로그래밍 분야에서 ICM의 기능 성숙을 평가하는 새로운 방법입니다. 또한 심근세포 분화 및 심장 기능을 평가하기 위해 적용 될 수 있습니다. 8~10개의 새끼를 얻는 것으로 시작하여 P0에서 P2 새끼까지 1,000만 개의 신생아 심장 섬유아세포 또는 NCF를 격리합니다.
저체온증으로 새끼를 심히 마취시합니다. 형광 현미경의 밑에 심혼을 관찰하기 위하여 원하는 유전자형을 가진 심혼이 심장 박동으로 GCaMP3에 의해 표시된 칼슘 플럭스를 보여줍니다 있는지 확인하기 위하여. 다른 유전자형은 형광을 나타내지 않습니다.
마음이 고립된 후, 네 조각으로 잘라서 느슨하게 연결됩니다. 얼음 차가운 덜벡코의 인산완충식염식염수(DPBS)에서 6센티미터 플레이트에서 철저히 씻어 낸다. 10분 동안 섭씨 37도에서 따뜻한 0.25%의 따뜻한 0.25%의 밀리리터로 하트를 소화합니다.
트립신 상체를 버리고 행크의 균형 잡힌 소금 용액에 밀리리터 웜 타입 2 콜라게나아제당 0.5 밀리리터 5밀리리터를 추가합니다. 혼합물을 철저히 소용돌이시키고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 다시, 혼합물을 철저히 소용돌이시키고 소화되지 않은 조직이 중력에 의해 정착하게합니다.
차가운 섬유아세포 배지의 5밀리리터와 함께 15 밀리리터 원추형 튜브에서 상체를 수집합니다. 파종 밀도가 입방 센티미터당 네 번째 세포에 2 ~2.5 배 10에 주위에 있도록 섬유 아세포 매체로 세포를 희석. 그런 다음 접시 나 접시에 세포를 시드.
부착 된 섬유 아세포는 시드 후 두 번째 날에 둥근 모양에 타원형이 있어야합니다. 제로 일째에, 섬유아세포 배지의 입방 센티미터당 제4 세포에 약 1~2배 의 밀도로 NCF를 시드한다. 첫날에는 배양 배지를 각각에 대한 배지를 함유하는 바이러스로 대체하고 원하는 대로 교체한다.
바이러스 감염 후 24시간 후, 배지를 함유하는 바이러스를 일반 ICM 배지로 대체한다. 실온에서 반전된 형광 현미경으로 칼슘 이온 플럭스를 평가합니다. 10X 목표 하에서 GCaMP3 양성 세포를 관찰하여 밝은 필드 채널에서 구타하는 자발적인 세포를 보여줍니다.
올바른 유전자형을 가진 심혼은 GCaMP3 밀가루로 시각화된 박동과 동기화된 칼슘 이온 플럭스를 보여주었습니다. 대조군 심혼에서는 형광이 관찰되지 않았습니다. 고립된 NCF는 2시간 이내에 우물에 부착되어 시드 후 하루 만에 둥근 모양으로 타원형을 보였다.
칼슘 이온 진동은 GCaMP3 형광 변화가 이러한 세포의 최대및 최소 및 칼슘 이온 진동 사이의 변을 주기적으로 변경한 것으로 나타났다. IMAP을 도입한 후, IMAP 배지 처리군에서 높은 전력장에 대한 칼슘 이온 플럭스를 가진 GCaMP3 양성 세포의 수가 증가함에 따라 대조군에서 구타 클러스터의 수가 훨씬 높았다. NCF는 고립 후 신선하게 준비하고 건강해야합니다.
심장 격리, 절단 및 적절한 소화 시간의 신속한 절차는 세포 생존력과 상태의 감소를 피하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 심장 재프로그래밍 연구원을 위한 기능성 maturated ICM을 식별하는 방법을 제공합니다. 여러 가지 추가 평가 방법을 사용하면 기능성 maturated ICM에 대해 보다 간결한 이해를 얻을 수 있습니다.
