Bu protokolde açıklanan yöntemler, kardiyak yeniden programlama çalışmaları için ICM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için değerli bir platform sağlayacaktır. Kalsiyum akısı sadece ICM'lerde görülür ve ICM fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmenin bir yolunu sağlar. Bu fare zorlanması değerlendirme prosedürlerini basitleştirir ve sonuçların tekrarlanabilirliğini artırır.
Bu protokol, kardiyak yeniden programlama alanında ICM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için yeni bir yöntemdir. Kardiyomiyosit farklılaşması ve kardiyak fonksiyonu değerlendirmek için de uygulanabilir. 10 milyon yenidoğan kardiyak fibroblast veya NCF'yi izole etmek için sekiz ila 10 yavru, P0 ila P2 yavruları elde ederek başlayın.
Yavruları hipotermi ile derinlemesine uyuşturun. İstenilen genotipe sahip kalbin, GCaMP3 tarafından kalplerin atışını göstererek kalsiyum akı gösterdiğiden emin olmak için floresan mikroskop altındaki kalpleri gözlemleyin. Diğer genotipler floresan göstermez.
Kalpleri izole ettikten sonra, gevşek bir şekilde bağlı olacak şekilde dört parçaya bölün. İzole hücrelerdeki kan hücresi kirliliğini sınırlamak için buz gibi Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde veya DPBS'de altı santimetrelik bir plakada birkaç kez iyice yıkayın. 37 santigrat derecede sekiz mililitre sıcak %0,25 Trypsin-EDTA ile kalpleri 10 dakika boyunca sindirin.
Trypsin süpernatantı atın ve Hank'in dengeli tuz çözeltisinde mililitre başına 0,5 miligram sıcak tip iki kollajenaz ekleyin. Karışımı iyice girdaplayın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe etti. Kuluçkadan sonra, tekrar, karışımı iyice girdaplayın ve sindirilmemiş dokunun yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.
Süpernatantı beş mililitre soğuk fibroblast ortamına sahip 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Hücreleri fibroblast ortamı ile seyreltin, böyle şekilde tohumlama yoğunluğu santimetreküp başına iki ila 2,5 çarpı 10 ila dördüncü hücreler civarındadır. Daha sonra hücreleri tabaklara veya tabaklara tohumlayın.
Ekli fibroblastlar, tohumlamadan sonraki ikinci günde ovalden yuvarlak şekle sahip olmalıdır. Sıfır gününde, NCF'leri fibroblast ortamında santimetreküp başına yaklaşık bir ila iki kez 10 ila dördüncü hücre yoğunluğuna tohumlayın. İlk gün, kültür ortamını her biri için istenen kadar orta içeren bir virüsle değiştirin.
2. günde, virüs enfeksiyonundan 24 saat sonra, orta içeren virüsü normal bir ICM ortamı ile değiştirin. Kalsiyum iyon akısını oda sıcaklığında ters floresan mikroskopla değerlendirin. GCaMP3 pozitif hücrelerini 10X hedefi altında gözlemleyin, parlak alan kanalında spontan hücrelerin attığını gösterdiğindan emin olmak.
Doğru genotipe sahip kalpler, GCaMP3 unescence olarak görselleştirilen, atım ile senkronize kalsiyum iyon akısı gösterdi. Kontrol kalplerinde floresan gözlenmedi. İki saat içinde kuyuya bağlı izole NCF'ler ve tohumlamadan bir gün sonra ovalden yuvarlak şekle kadar gösterdi.
Kalsiyum iyon salınımı GCaMP3 floresan değişiminin maksimum ve minimum arasında değiştiğini ve bu hücrelerin kalsiyum iyon salınımının periyodik olarak değiştiğini göstermiştir. IMAP'i tanıttıktan sonra, imap orta tedavi grubunda yüksek güç alanı için kalsiyum iyon akısı olan GCaMP3 pozitif hücrelerinin sayısı artırıldığı için, dayayan kümelerin sayısı kontrollü gruptakinden önemli ölçüde daha yüksekti. NCF'ler izolasyondan sonra taze hazırlanmalı ve sağlıklı olmalıdır.
Hızlı bir kalp izolasyonu, kesme ve uygun sindirim süresi prosedürü, hücre canlılığı ve durumunda azalmayı önlemeye yardımcı olabilir. Bu yöntem, kardiyak yeniden programlama araştırmacıları için fonksiyonel olgunlaşmalı ICM'leri tanımlamanın bir yolunu sağlar. Birden fazla değerlendirme yöntemiyle, fonksiyonel olgunlaşmış ICM'ler hakkında daha kısa bir anlayış elde edilebilir.
