Valutazione in vitro della riprogrammazione cardiaca mediante misurazione del flusso di calcio specifico cardiaco con un GCaMP3 Reporter

I metodi descritti in questo protocollo forniranno una preziosa piattaforma per valutare la maturazione funzionale degli ICM per gli studi di riprogrammazione cardiaca. Il flusso di calcio è osservato esclusivamente negli ICM e fornisce un modo per valutare la maturazione funzionale dell'ICM. Questo ceppo di topo semplifica le procedure di valutazione e migliora la riproducibilità dei risultati.

Questo protocollo è un nuovo metodo per valutare la maturazione funzionale degli ICM nel campo della riprogrammazione cardiaca. Può anche essere applicato per valutare la differenziazione dei cardiomiociti e la funzione cardiaca. Inizia ottenendo da otto a 10 cuccioli, da P0 a P2 per isolare 10 milioni di fibroblasti cardiaci neonatali o NCF.

Anestetizzare profondamente i cuccioli per ipotermia. Osservare i cuori al microscopio a fluorescenza per assicurarsi che il cuore con il genotipo desiderato mostri il flusso di calcio, indicato da GCaMP3 con i cuori che battono. Gli altri genotipi non mostreranno fluorescenza.

Dopo l'isolamento dei cuori, tagliali in quattro pezzi in modo che siano liberamente collegati. Lavali accuratamente più volte nella soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato di Dulbecco, o DPBS, in una piastra di sei centimetri per limitare l'inquinamento delle cellule del sangue nelle cellule isolate. Digerire i cuori con otto millilitri di tripsina-EDTA calda allo 0,25% a 37 gradi Celsius per 10 minuti.

Scartare il surnatante di tripsina e aggiungere cinque millilitri di 0,5 milligrammi per millilitro di collagenasi calda di tipo due nella soluzione salina bilanciata di Hank. Vortice la miscela accuratamente e incubata a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, di nuovo, ruotare accuratamente la miscela e lasciare che il tessuto non digerito si depositi per gravità.

Raccogliere il surnatante in un tubo conico da 15 millilitri con cinque millilitri di mezzo fibroblastico freddo. Diluire le cellule con mezzo fibroblastico in modo tale che la densità di semina sia di circa due a 2,5 volte 10 alle quarte cellule per centimetro cubo. Quindi seminare le cellule in piatti o piatti.

I fibroblasti attaccati dovrebbero avere una forma da ovale a rotonda il secondo giorno dopo la semina. Il giorno zero, seminare i NCF alla densità di circa una o due volte 10 alle quarte cellule per centimetro cubo nel mezzo fibroblastico. Il primo giorno sostituire il terreno di coltura con un terreno contenente virus per ogni bene desiderato.

Il giorno 2, 24 ore dopo l'infezione da virus, sostituire il mezzo contenente virus con un normale mezzo ICM. Valutare il flusso di ioni calcio con un microscopio a fluorescenza invertita a temperatura ambiente. Osservare le cellule GCaMP3 positive sotto l'obiettivo 10X, assicurandosi che mostrino cellule spontanee che battono nel canale brightfield.

I cuori con il genotipo corretto hanno mostrato un flusso di ioni calcio sincronizzato con il battito, visualizzato come farineria GCaMP3. Mentre nessuna fluorescenza è stata osservata nei cuori di controllo. NCF isolati attaccati al pozzo entro due ore e hanno mostrato una forma da ovale a rotonda un giorno dopo la semina.

L'oscillazione degli ioni calcio ha mostrato un cambiamento di fluorescenza GCaMP3 tra il massimo e il minimo e l'oscillazione degli ioni calcio di tali cellule è cambiata periodicamente. Dopo l'introduzione dell'IMAP, il numero di cluster di battitura era significativamente superiore a quello del gruppo controllato poiché il numero di cellule GCaMP3 positive con flusso di ioni calcio per un campo ad alta potenza era aumentato nel gruppo trattato con mezzo IMAP. I NCF dovrebbero essere preparati al momento e sani dopo l'isolamento.

Una rapida procedura di isolamento cardiaco, taglio e tempo di digestione corretta può aiutare a evitare la riduzione della vitalità e delle condizioni cellulari. Questo metodo fornisce un modo per identificare gli ICM maturati funzionali per i ricercatori di riprogrammazione cardiaca. Con più ulteriori metodi di valutazione, si può ottenere una comprensione più concisa degli ICM maturati funzionali.