Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden bieten eine wertvolle Plattform, um die funktionelle Reifung von ICMs für kardiale Reprogrammierungsstudien zu bewerten. Der Kalziumfluss wird ausschließlich in ICMs beobachtet und bietet eine Möglichkeit, die funktionelle Reifung des ICM zu bewerten. Dieser Mausstamm vereinfacht die Auswertungsverfahren und erhöht die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
Dieses Protokoll ist eine neue Methode zur Bewertung der funktionellen Reifung von ICMs im Bereich der kardialen Reprogrammierung. Es kann auch angewendet werden, um die Kardiomyozytendifferenzierung und die Herzfunktion zu bewerten. Beginnen Sie mit der Gewinnung von acht bis 10 Welpen, P0 bis P2 Welpen, um 10 Millionen neonatale Herzfibroblasten oder NCFs zu isolieren.
Betäuben Sie die Welpen tief durch Unterkühlung. Beobachten Sie die Herzen unter dem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass das Herz mit dem gewünschten Genotyp einen Kalziumfluss aufweist, der durch GCaMP3 bei schlagendem Herzen angezeigt wird. Die anderen Genotypen zeigen keine Fluoreszenz.
Nach der Isolierung der Herzen schneiden Sie sie in vier Teile, so dass sie lose verbunden sind. Waschen Sie sie mehrmals gründlich in eiskalter Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) in einer sechs Zentimeter großen Platte, um die Verschmutzung der Blutzellen in den isolierten Zellen zu begrenzen. Verdauen Sie die Herzen mit acht Millilitern warmem 0,25% Trypsin-EDTA in 37 Grad Celsius für 10 Minuten.
Verwerfen Sie den Trypsin-Überstand und fügen Sie fünf Milliliter von 0,5 Milligramm pro Milliliter warmer Typ-Zwei-Kollagenase in Hanks ausgewogene Salzlösung hinzu. Die Mischung gründlich vortreiben und bei 37 Grad Celsius fünf Minuten lang inkubieren. Nach der Inkubation erneut die Mischung gründlich wirbeln und das unverdaute Gewebe durch schwerkraft absetzen lassen.
Sammeln Sie den Überstand in einem konischen 15-Milliliter-Rohr mit fünf Millilitern kaltem Fibroblastenmedium. Verdünnen Sie die Zellen mit Fibroblastenmedium so, dass die Aussaatdichte etwa bei zwei bis 2,5 mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Kubikzentimeter liegt. Dann säen Sie die Zellen in Schalen oder Tellern.
Die angeschlossenen Fibroblasten sollten am zweiten Tag nach der Aussaat eine ovale bis runde Form haben. Am Tag Null säen Sie die NCFs auf die Dichte von etwa ein bis zwei mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Kubikzentimeter im Fibroblastenmedium. Ersetzen Sie am ersten Tag das Kulturmedium durch ein virushaltiges Medium für jeden Brunnen wie gewünscht.
Ersetzen Sie am Tag 2, 24 Stunden nach der Virusinfektion, das virushaltige Medium durch ein normales ICM-Medium. Beurteilen Sie den Calciumionenfluss mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop bei Raumtemperatur. Beobachten Sie die GCaMP3-positiven Zellen unter dem 10X-Objektiv und stellen Sie sicher, dass spontane Zellen im Hellfeldkanal schlagen.
Herzen mit dem richtigen Genotyp zeigten einen Kalziumionenfluss, der mit dem Schlagen synchronisiert war, visualisiert als GCaMP3-Fluoreszenz. Während keine Fluoreszenz in Kontrollherzen beobachtet wurde. Isolierte NCFs befestigten sich innerhalb von zwei Stunden an der Vertiefung und zeigten einen Tag nach der Aussaat eine ovale bis runde Form.
Die Calciumionenoszillation zeigte eine GCaMP3-Fluoreszenzänderung zwischen dem Maximum und dem Minimum und die Calciumionenoszillation solcher Zellen veränderte sich periodisch. Nach der Einführung von IMAP war die Anzahl der schlagenden Cluster signifikant höher als in der kontrollierten Gruppe, da die Anzahl der GCaMP3-positiven Zellen mit Calciumionenfluss für ein hohes Leistungsfeld in der mittelbehandelten IMAP-Gruppe erhöht war. NCFs sollten frisch zubereitet und nach der Isolierung gesund sein.
Ein schnelles Verfahren der Herzisolierung, des Schneidens und der richtigen Verdauungszeit kann dazu beitragen, eine Verringerung der Lebensfähigkeit und des Zustands der Zellen zu vermeiden. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, funktionell ausgereifte ICMs für Forscher der kardialen Reprogrammierung zu identifizieren. Mit mehreren weiteren Auswertungsmethoden kann man ein prägnanteres Verständnis über funktional ausgereifte ICMs erlangen.
