تنظم الخصائص البيوميكانيكية للخلايا والأنسجة وظيفتها وحيويتها. AFM يسمح القياس الكمي المبكر للهشاشة العظمية على المستوى الخلوي على أساس قياسات المرونة. AFM يسمح عمليات الاستحواذ على القياسات على مستوى خلوي دون الإضرار بالعينة وبدقة عالية، وموثوقية، وحساسية.
تحدث التغيرات في الممتلكات الميكانيكية الحيوية في وقت مبكر من هشاشة العظام. قياس المرونة المحلية للغضاريف المفصلية يسمح استخلاص استنتاجات صحيحة حول درجة انحطاط الأنسجة المحلية. لتقييم التغيرات التنكسية داخل مفصل الركبة البشرية، استخدم أولاً مشرطًا لقطع الغضروف المفصلي ككل من العظام تحت الصدرية وتضمين عينة الغضاريف في وسط تضمين قابل للذوبان في الماء على مقبض Cryotome الذي يتجمد تحت درجة حرارة منخفضة في جهاز Cryotome.
عندما تكون العينة قد جمدت، استخدم Cryotome القياسية للحصول على 35 ميكرومتر سميكة أجزاء من الأنسجة من الطبقة العليا من الغضروف المفصلي، وجمع كل قسم على الشرائح الزجاجية الفردية. عندما يتم الحصول على جميع الأقسام ، شطف العينات ثلاث مرات في PBS الطازجة لمدة خمس دقائق لكل غسل لإزالة وسيط التضمين القابل للذوبان في الماء. إزالة الشريحة الأولى من غسل.
بعد ذلك، أضف إلى اثنين إلى ثلاث قطرات من الغراء عينة متوافقة بيولوجيا في القسم الواحد في أطباق بيتري متوافقة مع AFM الفردية. إزالة أي حل الزائدة من العينة واضغط بلطف على حواف القسم المجفف على بقع الغراء. بعد دقيقتين، قم بتغطية الأنسجة المستعبدة بعناية باستخدام متوسط L-15 من Leibovitz بدون L-الجلوتامين ووضع الأطباق في حاضنة لثقافة الخلايا حتى يتم تحليل العينات.
لإعداد جهاز AFM، ضبط كتلة الغاز لقياس في بيئة سائلة على حامل AFM إلى أن السطح العلوي موازية لحامل، واستخدام ملاقط لتركيب بعناية cantilever مختارة على سطح كتلة الزجاج بحيث تلميح AFM مع microsphere يبرز على الطائرة البصرية مصقول. لتحقيق الاستقرار في النتليفر على الكتلة الزجاجية، حرك الربيع المعدني في أخدود الكتلة، واستخدم الملاقط لتضييق الخناق على الجزء العلوي من النتليفر مع الربيع. ضع الكتلة الزجاجية بعناية مع الـ cantilever على رأس AFM وقم بتأمين الكتلة مع آلية القفل المتكاملة.
ثم قم بتركيب رأس AFM مع الـ cantilever على جهاز AFM مع مواجهة الربيع إلى اليسار. لتركيب العينة على جهاز AFM، ضع طبق بيتري عينة على حامل عينة AFM وتعيين سخان طبق بيتري إلى 37 درجة مئوية. بعد حوالي 20 دقيقة، افتح برنامج الجهاز ومحاذاة الليزر ويندوز إعداد معلمة النهج.
بعد ذلك، بدوره على المحرك السائر، والضوء الليزر، وكاميرا CCD واستخدام وظيفة المحرك السائر لخفض cantilever في 100 micrometer الخطوات حتى يتم غمر تماما cantilever في الوسط. استخدام مسامير التكيف لتوجيه الليزر على رأس cantilever واستخدام مسامير الجهاز AFM لضبط شعاع الليزر بحيث يقع شعاع ينعكس على مركز ضوئي. مرة واحدة تم تعديل كانتيليف الليزر، ضبط الضوئية حسب الضرورة لتعيين إشارة المجموع إلى فولت واحد أو أعلى والانحرافات الجانبي والرأسي إلى ما يقرب من الصفر.
للحصول على منحنى قوة المعايرة، قم بتشغيل نهج الماسح الضوئي مع معلمات النهج كما هو موضح في الجدول. بمجرد الوصول إلى الجزء السفلي من طبق ثقافة الأنسجة ، تراجع عن المكنتر من قبل 100 ميكرومتر. قم بإعداد معلمات التشغيل كما هو موضح في الجدول.
وانقر تشغيل لبدء القياس والحصول على منحنى المسافة قوة المعايرة. يتم الحصول على منحنى القوة كما هو موضح في الشكل. في منحنى مسافة قوة المعايرة، حدد المنطقة لاحتواء خطي للمنحنى المتراجع.
مرة واحدة تناسب خطي في مكان، سيتم حفظ القيم من قبل البرنامج. ثم كما يتم تنفيذ القياسات في المتوسط في درجة حرارة 37 درجة مئوية، تعيين متغير درجة الحرارة في البرنامج إلى 37 درجة لمحاكاة الظروف الفسيولوجية بأكبر قدر ممكن. لتحديد أنماط conversite في أقسام عينة الغضاريف، وتحديد وتحديد الأنماط الخلوية المحددة للغضاريف المفصلية من الركبة العظمية على المجهر النقيض المرحلة، والتي قد تشمل سلاسل واحدة تدل على مناطق الأنسجة السليمة، والسلاسل المزدوجة التي تدل على بداية انحطاط الأنسجة، ومجموعات صغيرة، والتي هي علامات على انحطاط الأنسجة المتقدمة، ومجموعات كبيرة، تدل على تدمير الأنسجة في نهاية المرحلة.
وبمجرد تحديد نمط معين مطلوب، لوضع قياسات المصفوفة ال pericellular، و cantilever على مقربة من الخلايا وقياس موقعين لكل نمط مختار لكل نوع مصفوفة، تسع مرات لكل موقع قياس بما في ذلك حجم عينة كبيرة بما يكفي لحساب عدم الدقة المحتملة. التركيز على مصفوفة الخلوية من نمط لقياس وإصلاح فأرة الكمبيوتر في تلك المرحلة. بعد ذلك ، ركز على المسبار ونقل طرف المسبار إلى النقطة التي تم تثبيتها مسبقًا بواسطة سهم الكمبيوتر.
لإجراء قياسات المصفوفة خارج الخلية، حدد منطقة بدون أي خلايا وقم بإجراء نهج يتبعه تراجع بحيث يتم وضع الكنتليف 100 ميكرومتر فوق الأنسجة. ثم انقر فوق تشغيل لبدء القياسات، وذلك باستخدام المعلمة setpoint التي تم الحصول عليها عن طريق معايرة cantilever. لمعالجة البيانات التي تم الحصول عليها، فتح برامج معالجة البيانات المتوافقة مع البيانات التي تم الحصول عليها من جهاز AFM وحدد نموذج هيرست في البرنامج لمعالجة منحنيات مسافة القوة.
تعيين نسبة Poisson إلى 0.5، وشكل التلميح كروية، ونصف قطر الطرف إلى 12.5 ميكرومتر. وبمجرد تعديل جميع المعايير، سيتم تركيب النتائج وسيتم حساب معامل يونغ من قبل البرنامج. على طول النموذج فيزيووباولوجي من سلاسل إلى سلاسل مزدوجة ومن مجموعات صغيرة إلى كبيرة، كل من خارج الخلية ومصفوفة مرنة المغير مرنة انخفاض كبير بين كل تغيير نمط باستثناء بين السلاسل والسلاسل مزدوجة.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن نسبة المصفوفة خارج الخلية لا تتغير تغيرا كبيرا، في حين لوحظ انخفاض ملحوظ في الاختلافات المطلقة في المرونة بين المصفوفات خارج الخلية والعيّن. تعتمد قيم المرونة على ظروف مختلفة مثل عمق المسافة البادئة أو خصائص تلميح cantilever. وبالتالي فإن AFM هي الأنسب لمقارنة الظروف المختلفة داخل الإعداد التجريبي نفسه.
كما يقيس AFM المرونة المحلية للعينة، يجب أن تكون الأجزاء ثابتة في مكانها للسماح بقياس دقيق وتجنب تلف cantilever. لمزيد من تحليل العمليات المسؤولة عن التغيرات في مرونة الأنسجة، يمكن إجراء القياس الكمي الكيميائي الحيوي لهيكل البروتينات ذات الأهمية عبر البقع الغربية أو ELISAs.
