استخدام كريستال البنفسجي لتحسين البصرية Cytopathic تأثير القائم على القراءة ل Titration الفيروسية باستخدام TCID50 المقايسات

الهدف من هذا البروتوكول هو إنتاج صورة مخزون الفيروس وتصور ذلك باستخدام تلطيخ الكريستال البنفسجي. للقيام بذلك ، سيتم إثبات المعايرة الفيروسية العامة تليها التلطيخ. وسيتم إجراء هذا المعايرة في صفيحة من 96 بئرا لمدة سبعة أيام في خزانة السلامة البيولوجية داخل مختبر من المستوى 2 للسلامة البيولوجية.

للقيام بذلك، سيتم بذر لوحة 96 جيدا من خط الخلية المفضل باستخدام وسائل الإعلام المقابلة والسماح للنمو حتى التقاء. وسوف يكون مخزون الفيروس المخفف باستخدام تخفيف عشرة أضعاف، عن طريق خلط 900 ميكرولتر من وسائل الإعلام و 100 ميكرولتر من الفيروس، أو التخفيف المقابلة. تأكد من دوامة كل أنبوب لضمان الخلط السليم للوسائط والفيروس وتجنب الأخطاء على التخفيفات.

اكتب تخطيط لوحة الخاص بك في الرصاص، فضلا عن كل تخفيف للمساعدة أثناء عملية العدوى. قبل الإصابة، اغسل باستخدام 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 50 ميكرولتر من inoculum الخاص بك في الآبار المقابلة.

ثم، احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 لمدة سبعة أيام. بعد سبعة أيام حضانة، وغسل باستخدام 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من PFA في 4٪ في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة، تغسل الخلايا مرة أخرى مرتين مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل إضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من الكريستال البنفسجي في الماء واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، يستنشق البنفسجي الكريستال من الآبار واختياريا، وترك لوحات للهواء الجاف لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة أو غسله مع 200 ميكرولتر من الماء لإزالة وصمة عار مفرطة قبل التصور. ونتيجة لذلك، بعد إعادة تلطيخ، سيتم تلوين الخلايا السلبية.

سيتم تطهير الآبار الإيجابية. سيتم استخدام هذه المعلومات في إحدى الصيغتين الموصوفتين لحساب titer الفيروسي النهائي الخاص بك. عندما تمت مقارنة التيتر التي تم الحصول عليها مع كل طريقة، أظهرت أنه في تلطيخ الكيمياء أحادية الكيسة يمكن في بعض الحالات الكشف عن آبار إيجابية إضافية بالمقارنة مع الكريستال البنفسجي، وأنه بالمثل، يمكن لكلا أساليب التلطيخ الكشف عن آبار أكثر إيجابية من التقييم البصري عن طريق المجهر.