O objetivo deste protocolo é produzir uma titulação de estoque de vírus e visualizá-lo usando coloração violeta cristalina. Para isso, uma titulação viral geral será demonstrada seguida pela coloração. Esta titulação será realizada em uma placa de 96 poços por um período de sete dias em um armário de biossegurança dentro de um laboratório de biossegurança nível 2.
Para isso, uma placa de 96 poços da linha celular preferida será semeada usando a mídia correspondente e deixar crescer até confluente. O estoque do vírus será diluído usando diluições dez vezes, misturando 900 microliters de mídia e 100 microliters de vírus, ou a diluição correspondente. Certifique-se de vórtice de cada tubo para garantir a mistura adequada da mídia e do vírus e evitar erros nas diluições.
Escreva o layout da placa no lead, bem como cada diluição para ajudar durante o processo de infecção. Antes da infecção, lave usando 200 microliters de PBS. Adicione 50 microliters do seu inóculo nos poços correspondentes.
Em seguida, incubar a 37 graus celsius em uma incubadora de CO2 de 5% por sete dias. Após a incubação de sete dias, lave usando 200 microliters de PBS. Fixar as células adicionando 50 microliters por poço de PFA a 4% em PBS e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
Após a incubação, lave as células novamente duas vezes com 200 microliters de PBS antes da adição de 50 microliters por poço de violeta cristalina na água e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Por fim, aspirar o cristal violeta dos poços e, opcionalmente, deixar as placas secarem por dois a cinco minutos em temperatura ambiente ou lavá-la com 200 microliters de água para remover a mancha excessiva antes da visualização. Como resultado, após re coloração, as células negativas serão manchadas.
Poços positivos serão limpos. Essas informações serão usadas em uma das duas fórmulas descritas para calcular seu título viral final. Quando o título obtido com cada método foi comparado, mostrou que em monócito a coloração química poderia, em alguns casos, detectar poços positivos adicionais em comparação com o cristal violeta, e que da mesma forma, ambos os métodos de coloração poderiam detectar poços mais positivos do que a avaliação visual via microscopia.
