Utilisation de Crystal Violet pour améliorer la lecture visuelle basée sur les effets cytopathiques pour la tittration virale à l’aide des tests TCID50

L’objectif de ce protocole est de produire un titrage de stock de virus et de le visualiser à l’aide d’une coloration violette cristalline. Pour ce faire, un titrage viral général sera démontré suivi de la coloration. Ce titrage sera effectué dans une plaque de 96 puits pendant une période de sept jours dans une armoire de biosécurité au sein d’un laboratoire de niveau de biosécurité 2.

Pour ce faire, une plaque de 96 puits de la lignée cellulaire préférée sera ensemencée à l’aide du milieu correspondant et laissée croître jusqu’à confluent. Le stock de virus sera dilué en utilisant des dilutions décuplées, en mélangeant 900 microlitres de milieu et 100 microlitres de virus, ou la dilution correspondante. Assurez-vous de vortexer chaque tube pour assurer un bon mélange du milieu et du virus et éviter les erreurs sur les dilutions.

Écrivez la disposition de votre plaque dans le plomb ainsi que chaque dilution pour aider pendant le processus d’infection. Avant l’infection, laver à l’aide de 200 microlitres de PBS. Ajoutez 50 microlitres de votre inoculum dans les puits correspondants.

Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de CO2 pendant sept jours. Après l’incubation de sept jours, laver à l’aide de 200 microlitres de PBS. Fixez les cellules en ajoutant 50 microlitres par puits de PFA à 4% dans pbS et incubez pendant 15 minutes à température ambiante.

Après l’incubation, laver à nouveau les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS avant l’ajout de 50 microlitres par puits de violet cristallin dans l’eau et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Enfin, aspirez le cristal violet des puits et, éventuellement, laissez les plaques sécher à l’air libre pendant deux à cinq minutes à température ambiante ou lavez-les avec 200 microlitres d’eau pour éliminer les taches excessives avant la visualisation. En conséquence, après une nouvelle coloration, les cellules négatives seront colorées.

Les puits positifs seront dégagés. Cette information sera utilisée dans l’une des deux formules décrites pour calculer votre titre viral final. Lorsque le titre obtenu avec chaque méthode a été comparé, il a montré que dans la monocytochimie, la coloration pouvait dans certains cas détecter des puits positifs supplémentaires par rapport au violet cristallin, et que de même, les deux méthodes de coloration pouvaient détecter plus de puits positifs que l’évaluation visuelle par microscopie.