Использование кристаллической фиалки для улучшения визуального цитопатического эффекта для титрования вируса с использованием анализов TCID50

Цель этого протокола состоит в том, чтобы произвести титрование вирусных запасов и визуализировать его с помощью кристаллического фиолетового окрашивания. Для этого будет продемонстрировано общее вирусное титрование с последующим окрашиванием. Это титрование будет проводиться в 96-луночной пластине в течение семи дней в шкафу биобезопасности в лаборатории уровня биобезопасности 2.

Для этого 96-луночную пластину предпочтительной клеточной линии засеять с использованием соответствующей среды и дать расти до слияния. Вирусный запас будет разбавляться с помощью десятикратных разведений, путем смешивания 900 микролитров среды и 100 микролитров вируса, или соответствующего разведения. Обязательно вихрь каждой трубки, чтобы обеспечить правильное смешивание среды и вируса и избежать ошибок на разведениях.

Напишите макет вашей тарелки в свинце, а также каждое разведение, чтобы помочь во время процесса заражения. Перед заражением мойтесь, используя 200 микролитров PBS. Добавьте 50 микролитров вашего инокулята в соответствующие скважины.

Затем инкубируйте при температуре 37 градусов по Цельсию в инкубаторе с 5% CO2 в течение семи дней. После семидневной инкубации промыть, используя 200 микролитров PBS. Зафиксируйте клетки, добавив 50 микролитров на лунку PFA при 4% в PBS и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.

После инкубации дважды промыть клетки 200 микролитрами PBS перед добавлением 50 микролитров на лунку кристалла фиолетового в воде и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. Наконец, аспирируйте кристалл фиолетового цвета из лунок и по желанию оставьте пластины сушиться на воздухе в течение двух-пяти минут при комнатной температуре или промыть его 200 микролитрами воды, чтобы удалить лишние пятна перед визуализацией. В результате после повторного окрашивания отрицательные клетки будут окрашиваться.

Положительные скважины будут очищены. Эта информация будет использоваться в одной из двух описанных формул для расчета вашего окончательного вирусного титра. Когда титр, полученный с каждым методом, сравнивали, он показал, что в моноцитохимии окрашивание может в некоторых случаях обнаруживать дополнительные положительные лунки по сравнению с кристаллической фиалкой, и что аналогичным образом оба метода окрашивания могут обнаруживать больше положительных ямок, чем визуальная оценка с помощью микроскопии.