שימוש קריסטל ויולט כדי לשפר קריאה חזותית אפקט ציטוטופתי מבוסס עבור טיטציה ויראלית באמצעות TCID50 Assays

מטרת הפרוטוקול הזה היא לייצר טיטציה של מלאי וירוסים ולדמיין אותו באמצעות כתמים סגולים קריסטל. כדי לעשות זאת, טיטציה ויראלית כללית תודגם ואחריה הכתמים. טיטציה זו תבוצע בצלחת 96 באר לתקופה של שבעה ימים בארון בטיחות ביולוגית בתוך מעבדה ברמה 2 בטיחות ביולוגית.

כדי לעשות זאת, צלחת 96 באר של קו התא המועדף יהיה זרע באמצעות המדיה המתאימה ולתת לגדול עד confluent. מלאי הווירוס יהיה מדולל באמצעות דילול פי עשרה, על ידי ערבוב 900 מיקרוליטרים של מדיה ו 100 microliters של וירוס, או דילול המתאים. הקפד מערבולת כל צינור כדי להבטיח ערבוב נכון של התקשורת ואת הנגיף ולהימנע שגיאות על דילול.

כתוב את הפריסה של הצלחת שלך בעופרת, כמו גם כל דילול כדי לעזור במהלך תהליך ההדבקה. לפני ההדבקה, לשטוף באמצעות 200 microliters של PBS. הוסף 50 מיקרוליטרים של האינוקולום שלך בבארות המתאימות.

לאחר מכן, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%CO2 במשך שבעה ימים. לאחר הדגירה בת שבעת הימים, יש לשטוף בעזרת 200 מיקרוליטרים של PBS. תקן את התאים על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים לבאר של PFA ב 4% ב- PBS ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, לשטוף תאים שוב פעמיים עם 200 microliters של PBS לפני תוספת של 50 microliters לכל באר של סגול קריסטל במים ודגרה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שאפו סגול קריסטל מן בארות ובאופן אופציונלי, להשאיר את הצלחות לאוויר יבש במשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורת החדר או לשטוף אותו עם 200 microliters של מים כדי להסיר כתם מוגזם לפני הדמיה. כתוצאה מכך, לאחר הכתמה מחדש, תאים שליליים יהיו מוכתמים.

בארות חיוביות ינוקו. מידע זה ישמש באחת משתי הנוסחאות המתוארות לחישוב הצמיג הנגיפי הסופי שלך. כאשר הטייטר שהושג עם כל שיטה הושווה, זה הראה כי במונוציטו כימיה כתמים יכול במקרים מסוימים לזהות בארות חיוביות נוספות בהשוואה סגול קריסטל, וכי כמו כן, שתי שיטות הכתמה יכול לזהות בארות חיוביות יותר מאשר הערכה חזותית באמצעות מיקרוסקופיה.