Bu protokolün amacı bir virüs stok titrasyonu üretmek ve kristal mor boyama kullanarak görselleştirmektir. Bunu yapmak için, genel bir viral titrasyon ve ardından lekeleme gösterilecektir. Bu titrasyon, biyogüvenlik seviye 2 laboratuvarı içindeki bir biyogüvenlik kabininde yedi günlük bir süre boyunca 96 kuyulu bir plakada gerçekleştirilecektir.
Bunu yapmak için, tercih edilen hücre hattının 96 kuyulu bir plakası ilgili ortam kullanılarak tohumlanacak ve birleştiğinde büyümesine izin verilecektir. Virüs stoğu, 900 mikrolitre ortam ve 100 mikrolitre virüs veya karşılık gelen seyreltme karıştırılarak on kat seyreltme kullanılarak seyreltilecektir. Ortamın ve virüsün doğru şekilde karıştırılmasını sağlamak ve seyreltmelerdeki hataları önlemek için her tüpü girdaplayarak temizlemeyi unutmayın.
Enfeksiyon sürecinde yardımcı olmak için plakanızın düzenini ve her seyreltmeyi kurşuna yazın. Enfeksiyondan önce, 200 mikrolitre PBS kullanarak yıkayın. İlgili kuyulara 50 mikrolitre inoculum ekleyin.
Daha sonra, yedi gün boyunca% 5 CO2 inkübatörde 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Yedi günlük inkübasyondan sonra, 200 mikrolitre PBS kullanarak yıkayın. PBS'de %4'te PFA kuyusu başına 50 mikrolitre ekleyerek hücreleri sabitleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, sudaki kristal mor kuyusu başına 50 mikrolitre ilave etmeden önce hücreleri 200 mikrolitre PBS ile tekrar iki kez yıkayın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Son olarak, kuyulardan kristal menekşeyi epire edin ve isteğe bağlı olarak, plakaları oda sıcaklığında iki ila beş dakika kurumaya bırakın veya görselleştirmeden önce aşırı lekeyi gidermek için 200 mikrolitre su ile yıkayın. Sonuç olarak, yeniden lekelendikten sonra negatif hücreler lekelenir.
Pozitif kuyular temizlenecek. Bu bilgiler, son viral titrenizi hesaplamak için açıklanan iki formülden birinde kullanılacaktır. Her yöntemle elde edilen titer karşılaştırıldığında, monocyto kimyasında boyamanın bazı durumlarda kristal menekşe ile karşılaştırıldığında ek pozitif kuyular tespit edebildiği ve aynı şekilde her iki boyama yönteminin de mikroskopi ile görsel değerlendirmeden daha pozitif kuyular tespit edebildiği gösterildi.
