우리의 프로토콜은 과학자에게 인간 IPS와 신경 및 투명 유도체의 단일 세포 수준에서 여러 마이크로 매개 변수를 결합하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 미토콘드리아 부피 당 전체 수준과 특정 수준 모두에서 미토콘드리아 매개 변수의 즐거움을 허용합니다. 이 기술은 다른 신경 퇴행성 질환의 세포 유형을 포함한 여러 세포 유형에 적용될 수 있습니다.
따라서 이러한 질병 유형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 잠재적으로 치료 스크리닝에 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 세포를 6웰 플레이트의 4웰에 별도로 시드하고 50-60%의 컨플루언시가 달성될 때까지 세포를 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 배양 배지, FCCP, TMRE, MTG 및 미토 양말 스프레드의 다양한 조합을 포함하는 5개의 개별 염색 용액을 준비합니다.
그것들을 각각의 웰에 첨가하고, 원고에 기술된대로 세포를 배양한다. 다음으로 모든 우물에서 배지를 흡입하고 PBS로 씻으십시오. 세포 분리를 위해 섭씨 37도에서 5 분 동안 세포 해리 시약 1 밀리리터로 세포를 배양하십시오.
10% FBS가 보충된 DMEM 1밀리리터로 세포 해리 시약을 중화합니다. 그런 다음 15 밀리리터 크로니클 튜브에 우물 내용물을 모으십시오. 원통화에 의해 세포를 펠릿화하고 PBS로 세포 펠릿을 한두 번 세척한다.
모든 상청액을 흡인하여 튜브에 약 100 마이크로 리터를 남깁니다. 세포 펠릿을 300 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮긴 후 튜브를 실온의 어두운 곳에 보관하십시오.
텍스트 원고에 설명된 대역 통과 필터 설정이 있는 유세포분석기를 사용하여 세포를 분석합니다. 세포 해리 시약을 사용하여 약 100만 개의 세포를 분리하고 이전에 입증된 대로 세포를 펠릿 다운합니다. DMEM과 10%FBS로 세포 현탁액을 중화하고 15밀리리터 튜브에 현탁액을 수집합니다.
실온에서 1.6 % 파라 포름 알데히드 1 밀리리터로 세포를 10 분 동안 고정하십시오. 섭씨 영하 20도에서 20 분 동안 얼음처럼 차가운 90 % 메탄올 1 밀리리터로 세포를 투과시킵니다. 이어서 샘플을 1 밀리리터의 블로킹 완충액으로 차단하고, 입증된 바와 같이 PBS로 원심분리하여 세포를 세척한다.
상이한 미토콘드리아 복합체 및 서브유닛을 검출하기 위해, 텍스트 원고에 기술된 각각의 1차 항체와 함께 세포를 30분 동안 배양한다. 세포를 PBS로 1회 세척한 후, 세포를 2차 항체와 함께 30분 동안 배양한다. 인큐베이션의 끝에, 입증된 바와 같이 세포 및 PBS를 세척하고 재현탁시킨다.
세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 얼음 위의 어둠 속에 보관합니다. 다음으로, 유세포분석기에서 세포를 분석하고 신호를 검출한 후 5 30/30 대역 통과 필터를 사용하여 세포를 필터링합니다. 각 세포 부분모집단에 대해 히스토그램 플롯을 선택하고 서로 다른 필터 채널의 중앙값 형광 강도 또는 MFI를 분석합니다.
TMRE 수준, MMP ROS 복합 서브유닛 및 TFAM에 대한 특정 값을 텍스트 원고에 설명된 대로 계산한다. 유세포분석기 및 살아있는 세포를 MMP 미토콘드리아 부피 및 ROS 수준을 조사하기 위해 사용하였다. POLG DA 뉴런에서, 더 낮은 특이적 MMP 및 더 높은 특이적 ROS가 관찰된 반면, 미토콘드리아 부피, 총 MMP 및 ROS에는 변화가 없었다.
POLG 성상교세포는 MMP를 감소시켰지만, 미토콘드리아 부피 및 ROS에는 변화가 없었다. 유동 세포분석 및 고정 세포는 MRC 복합체 서브유닛 및 TFAM의 수준을 조사하기 위해 사용되었다. DA 뉴런은 대조군에 비해 증가된 복합체 1 및 TFAM을 나타냈지만, 복합체 2 수준에서는 변화가 없었다.
POLG 성상교세포는 복합체 14 및 특이적 TFAM의 감소를 나타내었다. 세포 밀도가 또한 MMP 및 MTG와 MMP 형광 사이의 관계에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이것은 세포 특이적이다. 이 프로토콜을 다른 세포 유형에 적용하려면 최적화가 필요할 수 있습니다. 이 절차에 따라 미토콘드리아 구조에 대한 추가 세부 정보를 제공하는 공초점 현미경과 같은 현미경 기반 asis를 수행할 수 있습니다.
따라서이 전략은 알려진 미토콘드리아 질환에서 DA 뉴런과 성상 세포에서 미토콘드리아 기능 장애를 감지하지만 이러한 기술은 모든 유형의 세포 및 질병에서 미토콘드리아 기능을 탐색하는 데에도 적용될 수 있습니다.
