Unser Protokoll bietet dem Wissenschaftler ein leistungsfähiges Werkzeug, um mehrere Mikroparameter auf Einzelzellebene aus humanem IPS und ihren neurologischen und klaren Derivaten zu verbinden. Diese Protokolle ermöglichen die Fröhlichkeit der mitochondrialen Parameter, sowohl auf der Gesamtebene als auch auf der spezifischen Ebene pro mitochondrialem Volumen, mittels Durchflusszytometrie. Diese Technik kann auf verschiedene Zelltypen angewendet werden, einschließlich solcher aus anderen neurodegenerativen Erkrankungen.
So kann es helfen, Einblicke in die Mechanismen hinter diesen Krankheitstypen zu geben und möglicherweise auch beim therapeutischen Screening zu helfen. Um zu beginnen, säen Sie die Zellen separat in vier Vertiefungen in einer Platte mit sechs Vertiefungen und inkubieren Sie die Zellen, bis 50 bis 60% Konfluenz erreicht ist. Am Ende der Kulturperiode fünf einzelne Färbelösungen mit unterschiedlichen Kombinationen von Kulturmedium, FCCP, TMRE, MTG und Mito Sockenaufstrich herstellen.
Fügen Sie sie in die jeweiligen Vertiefungen hinzu und inkubieren Sie die Zellen wie im Manuskript beschrieben. Als nächstes saugen Sie das Medium aus allen Vertiefungen ab und waschen Sie es mit PBS. Für die Zellablösung inkubieren Sie die Zellen mit einem Milliliter Zelldissoziationsreagenz bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.
Neutralisieren Sie das Zelldissoziationsreagenz mit einem Milliliter DMEM, ergänzt mit 10% FBS. Dann sammeln Sie den Brunneninhalt in einem 15-Milliliter-Chronikrohr. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifizierung und waschen Sie das Zellpellet ein- oder zweimal mit PBS.
Saugen Sie den gesamten Überstand ab und lassen Sie etwa 100 Mikroliter in der Röhre. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 300 Mikroliter PBS. Nach dem Einbringen der Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen das Röhrchen bei Raumtemperatur im Dunkeln halten.
Analysieren Sie die Zellen mit dem Durchflusszytometer mit den im Textmanuskript beschriebenen Bandpassfiltereinstellungen. Lösen Sie ungefähr 1 Million Zellen mit dem Zelldissoziationsreagenz ab und pelletieren Sie die Zellen wie zuvor gezeigt. Neutralisieren Sie die Zellsuspension mit DMEM plus 10% FBS und sammeln Sie die Suspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen.
Fixieren Sie die Zellen mit einem Milliliter 1,6% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Permeabolisieren Sie die Zellen mit einem Milliliter eiskaltem 90%Methanol bei minus 20 Grad Celsius für 20 Minuten. Dann blockieren Sie die Proben in einem Milliliter Blockierpuffer und waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation mit PBS, wie gezeigt.
Um verschiedene mitochondriale Komplexe und Untereinheiten nachzuweisen, inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten mit den jeweiligen primären Antikörpern, die im Textmanuskript beschrieben sind. Nachdem Sie die Zellen einmal mit PBS gewaschen haben, inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit sekundären Antikörpern. Am Ende der Inkubation waschen und suspendieren Sie die Zellen und PBS wie gezeigt.
Die Zellsuspension wird in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, das im Dunkeln auf Eis gehalten wird. Als nächstes analysieren Sie die Zellen auf dem Durchflusszytometer und erkennen Signale und filtern Sie eine mit einem 5 30/30-Bandpassfilter. Wählen Sie für jede Zellsubpopulation ein Histogrammdiagramm aus und analysieren Sie die mediane Fluoreszenzintensität oder MFI der verschiedenen Filterkanäle.
Berechnen Sie die TMRE-Ebenen, spezifische Werte für MMP ROS komplexe Untereinheit und TFAM, wie im Textmanuskript beschrieben. Durchflusszytometrie und lebende Zellen wurden verwendet, um das MMP-Mitochondrienvolumen und die ROS-Spiegel zu untersuchen. In POLG DA-Neuronen wurden niedrigere spezifische MMP und höhere spezifische ROS beobachtet, während keine Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des Gesamt-MMP und des ROS beobachtet wurden.
POLG-Astrozyten hatten MMP verringert, aber keine Veränderung des mitochondrialen Volumens und der ROS. Durchflusszytometrie und fixierte Zellen wurden verwendet, um das Niveau der MRC-Komplex-Untereinheit und TFAM zu untersuchen. DA-Neuronen zeigten erhöhte komplexe Eins und TFAM versus Kontrolle, aber keine Veränderung in komplexen zwei Ebenen.
POLG-Astrozyten zeigten eine Reduktion von Komplex eins vier und spezifischem TFAM. Da die Zelldichte auch MMP und die Beziehung zwischen MTG- und MMP-Fluoreszenz beeinflussen kann, ist dies zellspezifisch. Die Anpassung dieses Protokolls an andere Zelltypen erfordert wahrscheinlich eine Optimierung Nach diesem Verfahren kann eine mikroskopisch basierte ASIS, zum Beispiel eine konfokale Mikrokopie, durchgeführt werden, die zusätzliche Details der mitochondrialen Strukturen liefert.
Während diese Strategie also mitochondriale Dysfunktion in DA-Neuronen und Astrozyten aus einer bekannten mitochondrialen Erkrankung erkennt, können diese Techniken auch angewendet werden, um die mitochondriale Funktion in jeder Art von Zelle und Krankheit zu erforschen.
