Nosso protocolo fornece ao cientista uma ferramenta poderosa para casar vários microparâmetros em nível de célula única do IPS humano e seus derivados neuro e claros. Esses protocolos permitem a fusão de parâmetros mitocondriais, tanto no nível total quanto no nível específico por volume mitocondrial, utilizando citometria de fluxo. Esta técnica pode ser aplicada a vários tipos de células, incluindo as de outras doenças neurodegenerativas.
Assim, pode ajudar a fornecer informações sobre os mecanismos por trás desses tipos de doenças e também potencialmente ajudar na triagem terapêutica. Para começar, semeie as células separadamente em quatro poços em uma placa de seis poços e incube as células até que 50 a 60% de confluência seja alcançada. No final do período de cultura, preparar cinco soluções de coloração individuais contendo diferentes combinações de meio de cultura, FCCP, TMRE, MTG e mito sock spread.
Adicione-os aos respectivos poços e incube as células conforme descrito no manuscrito. Em seguida, aspirar o meio de todos os poços e lavar com PBS. Para o descolamento celular, incubar as células com um mililitro de reagente de dissociação celular a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Neutralizar o reagente de dissociação celular com um mililitro de DMEM, suplementado com 10% FBS. Em seguida, colete o conteúdo do poço em um tubo de crônica de 15 mililitros. Pellet para baixo as células por centrificação e lavar o pellet celular com PBS uma ou duas vezes.
Aspirar todo o sobrenadante, deixando aproximadamente 100 microlitros no tubo. Ressuspeite os pellets de células em 300 microlitros de PBS. Depois de transferir a suspensão da célula para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, mantenha o tubo no escuro à temperatura ambiente.
Analise as células usando o citômetro de fluxo com as configurações de filtro passa-banda descritas no manuscrito do texto. Desprenda aproximadamente 1 milhão de células usando o reagente de dissociação celular e elimine as células, como demonstrado anteriormente. Neutralize a suspensão celular com DMEM mais 10% FBS e recolha a suspensão num tubo de 15 mililitros.
Fixe as células com um mililitro de paraformaldeído a 1,6% à temperatura ambiente durante 10 minutos. Permeabolir as células com um mililitro de metanol gelado a 90% de metanol a menos 20 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, bloqueie as amostras em um mililitro de tampão de bloqueio e lave as células por centrifugação com PBS, conforme demonstrado.
Para detectar diferentes complexos e subunidades mitocondriais, incubar as células por 30 minutos com os respectivos anticorpos primários descritos no manuscrito do texto. Depois de lavar as células uma vez com PBS, incube as células com anticorpos secundários por 30 minutos. No final da incubação, lave e ressuscite as células e o PBS, conforme demonstrado.
Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, mantido no escuro no gelo. Em seguida, analise as células no citômetro de fluxo e detecte sinais e filtre um usando um filtro de passagem de banda 5 30/30. Para cada subpopulação celular, selecione um gráfico de histograma e analise a intensidade de fluorescência mediana ou MFI dos diferentes canais filtrantes.
Calcular os níveis de TMRE, valores específicos para a subunidade complexa MMP ROS e TFAM, conforme descrito no manuscrito do texto. A citometria de fluxo e células vivas foi utilizada para investigar o volume mitocondrial de MMP e os níveis de EROs. Nos neurônios POLG DA, observou-se menor MMP específica e ROS específicas mais altas, enquanto não houve alterações no volume mitocondrial, MMP total e ROS.
Os astrócitos POLG apresentaram diminuição da MMP, mas nenhuma alteração no volume mitocondrial e nas EROs. A citometria de fluxo e as células fixas foram utilizadas para investigar o nível de subunidade complexa MRC e TFAM. Os neurônios DA mostraram aumento do complexo um e TFAM versus controle, mas nenhuma alteração no nível do complexo dois.
Os astrócitos POLG mostraram uma redução do complexo um quatro e TFAM específico. Como a densidade celular também pode influenciar a MMP e a relação entre a fluorescência MTG e MMP, isso é específico da célula. Adaptar este protocolo a outros tipos de células provavelmente exigirá otimização Após este procedimento, a asis baseada em microscopia, por exemplo, microcópia confocal pode ser realizada, fornecendo detalhes adicionais das estruturas mitocondriais.
Assim, enquanto esta estratégia detecta disfunção mitocondrial em neurônios DA e astrócitos de uma doença mitocondrial conhecida, essas técnicas também podem ser aplicadas para explorar a função mitocondrial em qualquer tipo de célula e doença.
