私たちのプロトコルは、ヒトIPSとその神経および明確な誘導体からの単一細胞レベルで複数のマイクロパラメータを結合するための強力なツールを科学者に提供します。このプロトコルは、フローサイトメトリーを使用して、ミトコンドリア体積あたりの総レベルと特定のレベルの両方でミトコンドリアパラメータの喜びを可能にします。この技術は、他の神経変性疾患からのものを含むいくつかの細胞型に適用することができる。
したがって、それによって、これらの疾患タイプの背後にあるメカニズムへの洞察を提供するのに役立ち、治療スクリーニングにも役立つ可能性があります。まず、細胞を6ウェルプレートの4つのウェルに別々に播種し、50〜60%のコンフルエンシーが達成されるまで細胞をインキュベートします。培養期間の最後に、培地、FCCP、TMRE、MTG、および水戸ソックススプレッドの異なる組み合わせを含む5つの個別の染色液を調製します。
それらをそれぞれのウェルに加え、原稿に記載されているように細胞をインキュベートします。次に、すべてのウェルから培地を吸引し、PBSで洗浄します。細胞剥離のために、1ミリリットルの細胞解離試薬と37°Cで5分間細胞をインキュベートします。
細胞解離試薬を10%FBSを添加した1ミリリットルのDMEMで中和します。それから15ミリリットルのクロニクルチューブに井戸の内容物を集めます。遠心分離によって細胞をペレット化し、細胞ペレットをPBSで1〜2回洗浄します。
すべての上清を吸引し、チューブ内に約100マイクロリットルを残します。細胞ペレットを300マイクロリットルのPBSに再懸濁します。細胞懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移した後、チューブを室温で暗所に保ちます。
テキスト原稿に記載されているバンドパスフィルター設定のフローサイトメーターを使用して細胞を分析します。細胞解離試薬を使用して約100万個の細胞を分離し、前述のように細胞をペレットダウンします。細胞懸濁液をDMEMと10%FBSで中和し、懸濁液を15ミリリットルのチューブに集めます。
細胞を1ミリリットルの1.6%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定します。1ミリリットルの氷冷90%メタノールをマイナス20°Cで20分間透過処理します。次に、1ミリリットルのブロッキングバッファーでサンプルをブロックし、実証されているようにPBSで遠心分離して細胞を洗浄します。
異なるミトコンドリア複合体およびサブユニットを検出するには、テキスト原稿に記載されているそれぞれの一次抗体で細胞を30分間インキュベートします。細胞をPBSで一度洗浄した後、細胞を二次抗体で30分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、実証されたように細胞およびPBSを洗浄し、再懸濁する。
細胞懸濁液を氷上で暗所に保たれた1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移す。次に、フローサイトメーターで細胞を分析し、シグナルを検出し、5 30/30バンドパスフィルターを使用して1つをフィルタリングします。各細胞亜集団について、ヒストグラムプロットを選択し、異なるフィルターチャンネルの蛍光強度またはMFIの中央値を解析します。
TMREレベル、MMP ROS複合体サブユニットおよびTFAMの特定の値を、テキスト原稿に記載されているように計算します。フローサイトメトリーおよび生細胞を用いて、MMPミトコンドリア容積およびROSレベルを調査した。POLG DAニューロンでは、より低い特異的MMPおよびより高い特異的ROSが観察されたが、ミトコンドリア容積、総MMPおよびROSに変化は見られなかった。
POLG星状細胞はMMPを減少させたが、ミトコンドリア容積およびROSに変化はなかった。フローサイトメトリーおよび固定細胞を用いて、MRC複合体サブユニットおよびTFAMのレベルを調べた。DAニューロンは、対照と比較して複合体1およびTFAMの増加を示したが、複合体2レベルに変化はなかった。
POLG星状細胞は、複合体一4および特異的TFAMの減少を示した。細胞密度はMMPおよびMTGとMMP蛍光の関係にも影響を与える可能性があるため、これは細胞特異的です。このプロトコルを他の細胞型に適応させるには、おそらく最適化が必要になるでしょう この手順に続いて、顕微鏡ベースのアシス、例えば共焦点マイクロコピーを実行することができ、ミトコンドリア構造の追加の詳細を提供します。
したがって、この戦略は、既知のミトコンドリア疾患からDAニューロンおよび星状細胞のミトコンドリア機能障害を検出する一方で、これらの技術は、あらゆるタイプの細胞および疾患におけるミトコンドリア機能の探索にも適用できます。
