Nuestro protocolo proporciona al científico una poderosa herramienta para unir múltiples micro parámetros a nivel de una sola célula de IPS humano y sus derivados neuro y claros. Estos protocolos permiten la merriación de los parámetros mitocondriales, tanto a nivel total como a nivel específico por volumen mitocondrial, mediante citometría de flujo. Esta técnica se puede aplicar a varios tipos de células, incluidas las de otras enfermedades neurodegenerativas.
Por lo tanto, puede ayudar a proporcionar información sobre los mecanismos detrás de estos tipos de enfermedades y también ayudar potencialmente en la detección terapéutica. Para comenzar, siembre las células por separado en cuatro pocillos en una placa de seis pocillos e incube las células hasta que se logre una confluencia del 50 al 60%. Al final del período de cultivo, prepare cinco soluciones de tinción individuales que contengan diferentes combinaciones de medio de cultivo, FCCP, TMRE, MTG y extensión de mito sock.
Agréguelos a los pozos respectivos e incube las células como se describe en el manuscrito. A continuación, aspire el medio de todos los pocillos y lave con PBS. Para el desprendimiento celular, incubar las células con un mililitro de reactivo de disociación celular a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
Neutralizar el reactivo de disociación celular con un mililitro de DMEM, suplementado con 10% FBS. Luego recoja el contenido del pozo en un tubo de crónica de 15 mililitros. Granular las células por centrificación y lavar el pellet de la célula con PBS una o dos veces.
Aspirar todo el sobrenadante, dejando aproximadamente 100 microlitros en el tubo. Vuelva a suspender los gránulos celulares en 300 microlitros de PBS. Después de transferir la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, mantenga el tubo en la oscuridad a temperatura ambiente.
Analice las células utilizando el citómetro de flujo con la configuración del filtro de paso de banda descrita en el texto manuscrito. Separar aproximadamente 1 millón de células utilizando el reactivo de disociación celular y granular las células como se demostró anteriormente. Neutralice la suspensión celular con DMEM más 10% FBS y recoja la suspensión en un tubo de 15 mililitros.
Fije las células con un mililitro de paraformaldehído al 1,6% a temperatura ambiente durante 10 minutos. Permeabolizar las células con un mililitro de hielo frío 90% de metanol a menos 20 grados centígrados durante 20 minutos. Luego bloquee las muestras en un mililitro de tampón de bloqueo y lave las células por centrifugación con PBS, como se demuestra.
Para detectar diferentes complejos y subunidades mitocondriales, incubar las células durante 30 minutos con los respectivos anticuerpos primarios descritos en el texto manuscrito. Después de lavar las células una vez con PBS, incubar las células con anticuerpos secundarios durante 30 minutos. Al final de la incubación, lavar y volver a suspender las células y PBS como se demuestra.
Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, mantenido en la oscuridad sobre hielo. A continuación, analice las células en el citómetro de flujo y detecte señales y filtre una utilizando un filtro de paso de banda 5 30/30. Para cada subpoblación celular, seleccione un gráfico de histograma y analice la intensidad media de fluorescencia o MFI de los diferentes canales de filtro.
Calcular los niveles de TMRE, valores específicos para la subunidad compleja MMP ROS y TFAM, como se describe en el texto manuscrito. Se utilizó citometría de flujo y células vivas para investigar el volumen mitocondrial MMP y los niveles de ROS. En las neuronas POLG DA, se observó una MMP específica más baja y una ROS específica más alta, mientras que no hubo cambios en el volumen mitocondrial, MMP total y ROS.
Los astrocitos POLG habían disminuido la MMP, pero no hubo cambios en el volumen mitocondrial y ROS. Se utilizó citometría de flujo y células fijas para investigar el nivel de subunidad del complejo MRC y TFAM. Las neuronas DA mostraron un aumento del complejo uno y TFAM versus control, pero ningún cambio en el complejo de dos niveles.
Los astrocitos POLG mostraron una reducción del complejo uno cuatro y TFAM específico. Como la densidad celular también puede influir en MMP y la relación entre MTG y fluorescencia MMP, esto es específico de la célula. La adaptación de este protocolo a otros tipos de células probablemente requerirá optimización. Después de este procedimiento, se puede realizar una microscopía basada en asis, por ejemplo, microscopía confocal, que proporciona detalles adicionales de las estructuras mitocondriales.
Entonces, si bien esta estrategia detecta la disfunción mitocondrial en las neuronas DA y los astrocitos de una enfermedad mitocondrial conocida, estas técnicas también se pueden aplicar para explorar la función mitocondrial en cualquier tipo de célula y enfermedad.
