Protokolümüz, bilim insanına insan IPS'sinden ve bunların nöro ve net türevlerinden tek hücre düzeyinde birden fazla mikro parametreyi birleştirmek için güçlü bir araç sağlar. Bu protokoller, akış sitometrisini kullanarak mitokondriyal parametrelerin hem toplam seviyede hem de mitokondriyal hacim başına spesifik seviyede neşelendirilmesine izin verir. Bu teknik, diğer nörodejeneratif hastalıklardan olanlar da dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine uygulanabilir.
Bu nedenle, bu hastalık türlerinin arkasındaki mekanizmalar hakkında fikir edinmeye yardımcı olabilir ve ayrıca terapötik taramaya potansiyel olarak yardımcı olabilir. Başlamak için, hücreleri altı kuyucuklu bir plakada ayrı ayrı dört kuyucuğa tohumlayın ve% 50 ila% 60 akıcılık elde edilene kadar hücreleri inkübe edin. Kültür döneminin sonunda, kültür ortamı, FCCP, TMRE, MTG ve mito çorap yayılımının farklı kombinasyonlarını içeren beş ayrı boyama çözeltisi hazırlayın.
Onları ilgili kuyucuklara ekleyin ve el yazmasında açıklandığı gibi hücreleri inkübe edin. Daha sonra, ortamı tüm kuyucuklardan aspire edin ve PBS ile yıkayın. Hücre ayrılması için, hücreleri beş dakika boyunca 37 santigrat derecede bir mililitre hücre ayrışma reaktifi ile inkübe edin.
Hücre ayrışma reaktifini% 10 FBS ile desteklenmiş bir mililitre DMEM ile nötralize edin. Ardından kuyu içeriğini 15 mililitrelik bir kronik tüpte toplayın. Hücreleri merkezleme yoluyla toplayın ve hücre peletini PBS ile bir veya iki kez yıkayın.
Tüm süpernatanı aspire edin, tüpte yaklaşık 100 mikrolitre bırakın. Hücre peletlerini 300 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktardıktan sonra, tüpü oda sıcaklığında karanlıkta tutun.
Metin makalesinde açıklanan bant geçiş filtresi ayarlarıyla akış sitometresini kullanarak hücreleri analiz edin. Hücre ayrışma reaktifini kullanarak yaklaşık 1 milyon hücreyi ayırın ve daha önce gösterildiği gibi hücreleri topaklayın. DMEM artı% 10FBS ile hücre süspansiyonunu nötralize edin ve süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.
Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir mililitre% 1.6 paraformaldehit ile sabitleyin. Hücreleri 20 dakika boyunca eksi 20 santigrat derecede bir mililitre buz soğuk% 90 metanol ile geçirgenleştirin. Daha sonra numuneleri bir mililitre bloke edici tamponda bloke edin ve gösterildiği gibi hücreleri PBS ile santrifüjleme ile yıkayın.
Farklı mitokondriyal kompleksleri ve alt birimleri tespit etmek için, metin makalesinde açıklanan ilgili birincil antikorlarla hücreleri 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri PBS ile bir kez yıkadıktan sonra, hücreleri 30 dakika boyunca ikincil antikor ile inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, gösterildiği gibi hücreleri ve PBS'yi yıkayın ve yeniden askıya alın.
Hücre süspansiyonunu, buz üzerinde karanlıkta tutulan 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, akış sitometresindeki hücreleri analiz edin ve sinyalleri tespit edin ve 5 30/30 bantlı bir geçiş filtresi kullanarak filtreleyin. Her hücre alt popülasyonu için bir histogram grafiği seçin ve farklı filtre kanallarının medyan floresan yoğunluğunu veya MFI'sini analiz edin.
Metin makalesinde açıklandığı gibi TMRE seviyelerini, MMP ROS karmaşık alt birimi ve TFAM için spesifik değerleri hesaplayın. MMP mitokondriyal volüm ve ROS düzeylerini araştırmak için akım sitometrisi ve canlı hücreler kullanıldı. POLG DA nöronlarında, daha düşük spesifik MMP ve daha yüksek spesifik ROS gözlenirken, mitokondriyal hacim, toplam MMP ve ROS'ta herhangi bir değişiklik gözlenmedi.
POLG astrositleri MMP'yi azaltmıştı, ancak mitokondriyal hacim ve ROS'ta bir değişiklik yoktu. MRC kompleks alt birimi ve TFAM düzeyini araştırmak için akım sitometrisi ve sabit hücreler kullanıldı. DA nöronları artmış kompleks bir ve TFAM'ye karşı kontrol gösterdi, ancak karmaşık iki seviyede bir değişiklik olmadı.
POLG astrositleri, karmaşık bir dört ve spesifik TFAM'de bir azalma gösterdi. Hücre yoğunluğu MMP'yi ve MTG ile MMP floresansı arasındaki ilişkiyi de etkileyebileceğinden, bu hücreye özgüdür. Bu protokolün diğer hücre tiplerine uyarlanması muhtemelen optimizasyon gerektirecektir Bu prosedürü takiben, mitokondriyal yapıların ek ayrıntılarını sağlayan mikroskobik tabanlı asis, örneğin konfokal mikroskopi gerçekleştirilebilir.
Bu nedenle, bu strateji bilinen bir mitokondriyal hastalıktan DA nöronlarında ve astrositlerinde mitokondriyal disfonksiyonu tespit ederken, bu teknikler herhangi bir hücre ve hastalık türünde mitokondriyal fonksiyonu keşfetmek için de uygulanabilir.
