Il nostro protocollo fornisce allo scienziato un potente strumento per sposare più micro parametri a livello di singola cellula da IPS umano e dai loro derivati neuro e chiari. Questi protocolli consentono di ottenere l'arricchimento dei parametri mitocondriali, sia a livello totale che a livello specifico per volume mitocondriale, utilizzando la citometria a flusso. Questa tecnica può essere applicata a diversi tipi di cellule, comprese quelle di altre malattie neurodegenerative.
Quindi, può quindi aiutare a fornire informazioni sui meccanismi alla base di questi tipi di malattia e anche potenzialmente aiutare nello screening terapeutico. Per iniziare, seminare le cellule separatamente in quattro pozzetti in una piastra a sei pozzetti e incubare le cellule fino a raggiungere il 50-60% di confluenza. Alla fine del periodo di coltura, preparare cinque singole soluzioni coloranti contenenti diverse combinazioni di terreno di coltura, FCCP, TMRE, MTG e mito sock spread.
Aggiungerli nei rispettivi pozzetti e incubare le cellule come descritto nel manoscritto. Quindi, aspirare il mezzo da tutti i pozzetti e lavare con PBS. Per il distacco cellulare, incubare le cellule con un millilitro di reagente di dissociazione cellulare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Neutralizzare il reagente di dissociazione cellulare con un millilitro di DMEM, integrato con 10% FBS. Quindi raccogliere il contenuto del pozzo in un tubo cronico da 15 millilitri. Pellet lungo le cellule mediante centrificazione e lavare il pellet cellulare con PBS una o due volte.
Aspirare tutto il surnatante, lasciando circa 100 microlitri nel tubo. Risospendere i pellet cellulari in 300 microlitri di PBS. Dopo aver trasferito la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri, tenere il tubo al buio a temperatura ambiente.
Analizzare le cellule utilizzando il citometro a flusso con le impostazioni del filtro passa banda descritte nel manoscritto di testo. Staccare circa 1 milione di cellule usando il reagente di dissociazione cellulare e pellet giù le cellule come dimostrato in precedenza. Neutralizzare la sospensione cellulare con DMEM più 10% FBS e raccogliere la sospensione in un tubo da 15 millilitri.
Fissare le cellule con un millilitro di paraformaldeide all'1,6% a temperatura ambiente per 10 minuti. Permeare le cellule con un millilitro di metanolo ghiacciato al 90% a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi bloccare i campioni in un millilitro di tampone bloccante e lavare le cellule mediante centrifugazione con PBS, come dimostrato.
Per rilevare diversi complessi e subunità mitocondriali, incubare le cellule per 30 minuti con i rispettivi anticorpi primari descritti nel manoscritto testuale. Dopo aver lavato le cellule una volta con PBS, incubare le cellule con anticorpi secondari per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare e risospendere le cellule e il PBS come dimostrato.
Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri, tenuto al buio sul ghiaccio. Successivamente, analizzare le cellule sul citometro a flusso e rilevare i segnali e filtrarne uno utilizzando un filtro passa banda 5 30/30. Per ogni sottopopolazione cellulare, selezionare un grafico dell'istogramma e analizzare l'intensità mediana della fluorescenza o MFI dei diversi canali filtranti.
Calcolare i livelli TMRE, i valori specifici per la subunità complessa MMP ROS e TFAM, come descritto nel manoscritto testuale. La citometria a flusso e le cellule vive sono state utilizzate per studiare il volume mitocondriale MMP e i livelli di ROS. Nei neuroni POLG DA, è stata osservata MMP specifica inferiore e ROS specifico più alto, mentre non sono stati osservati cambiamenti nel volume mitocondriale, MMP totale e ROS.
Gli astrociti POLG avevano diminuito MMP, ma nessun cambiamento nel volume mitocondriale e ROS. La citometria a flusso e le cellule fisse sono state utilizzate per studiare il livello della subunità complessa MRC e TFAM. I neuroni DA hanno mostrato un aumento del complesso uno e TFAM rispetto al controllo, ma nessun cambiamento nel complesso due livelli.
Gli astrociti POLG hanno mostrato una riduzione del complesso uno quattro e TFAM specifico. Poiché la densità cellulare può anche influenzare MMP e la relazione tra fluorescenza MTG e MMP, questo è specifico della cellula. L'adattamento di questo protocollo ad altri tipi di cellule richiederà probabilmente un'ottimizzazione Seguendo questa procedura, è possibile eseguire asis a base microscopica, ad esempio la microscopia confocale, fornendo ulteriori dettagli sulle strutture mitocondriali.
Quindi, mentre questa strategia rileva la disfunzione mitocondriale nei neuroni DA e negli astrociti da una nota malattia mitocondriale, queste tecniche possono anche essere applicate per esplorare la funzione mitocondriale in qualsiasi tipo di cellula e malattia.
