Доставка лекарств в мозг оставалась проблемой. Разработка больших панелей новых наноматериалов для улучшения доставки в мозг подчеркивает необходимость реальной микросистемы in vitro для прогнозирования проникновения в мозг в рамках доклинических анализов. Основным преимуществом этой техники является замораживание свободной боли клеточных актуалов гематоэнцефалического барьера внутри той же системы, позволяющей клеточным коммуникациям, необходимым для индукции фенотипа гематоэнцефалического барьера.
Кроме того, каждый тип клеток может быть выделен отдельно для дальнейшего молекулярного анализа. Модель может быть использована для широкого спектра экспериментов в здоровых и патологических состояниях и представляет собой ценный инструмент для доклинических оценок транспорта молекул и частиц, а также меж- и внутриклеточного трафика. Демонстрировать процедуру будут д-р Клеманс Делинь и д-р Элеонора Рицци.
Начните с кодирования скважин 500 микролитрами двух микрограммов на квадратный сантиметр раствора поли-L-лизина. Инкубируйте в течение ночи или в течение как минимум одного часа при температуре 37 градусов Цельсия и осторожно удалите раствор Поли-L-Лизина стеклянной пипеткой, подключенной к аспирационной системе. Затем дважды смойте стерильной водой.
Чтобы собрать астроциты, сначала промыть астроциты один раз 10 миллилитрами теплого 1X PBS CMF. Инкубируйте их в течение трех минут с 10 миллилитрами теплого 20%-ного раствора трипсина ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислого газа и 21% кислорода. Механически отделяют ячейки от колбы и переносят суспензию в коническую трубку, содержащую пять миллилитров теплого неразбавленного FCS.
Центрифугируйте суспензию в 190 раз G в течение пяти минут при 20 градусах Цельсия. Повторно суспендировать клеточную гранулу в пяти миллилитрах теплой астроцитарной среды, затем разбавить 20 микролитров клеточной суспензии 80 микролитрами 1X PBS CMF. Подсчитывайте клетки с помощью ручной счетной камеры под микроскопом.
Пластина около 40 000 клеток на квадратный сантиметр в каждом поли-L-лизине предварительно закодирована хорошо в объеме 1,5 миллилитра теплой астроцитарной среды. Поместите реверсивные вставные фильтры на периферии закрытой тарелки высотой 25 миллиметров и добавьте 250 микролитров коллагена типа один раствор к вставным фильтрам. Инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа.
Затем аккуратно удалите раствор коллагена типа one со стеклянной пипеткой, подключенной к аспирационной системе. Дважды промыть 250 микролитрами DMEM высокой глюкозы при комнатной температуре и аккуратно удалить весь раствор из вставных фильтров. Дважды промыть перициты 10 миллилитрами теплого 1X PBS CMF и инкубировать клетки двумя миллилитрами теплого трипсина.
Наблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы контролировать действие трипсина. Когда клетки начнут отделяться, удалите трипсин, затем добавьте пять миллилитров теплой базальной среды эндотелиальных клеток или ECM к клеткам и начните механическую диссоциацию. Разбавьте 20 микролитров клеточной суспензии 80 микролитрами 1X PBS CMF и подсчитайте ячейки с помощью ручной счетной камеры под микроскопом, как показано ранее.
Seed 44, 500 ячеек на сантиметр в квадрате на предварительно закодированных реверсивных вставных фильтрах объемом 250 микролитров. Держите вставные фильтры в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов под 5% углекислого газа и 21% кислорода. Используйте стерильный пинцет, чтобы аккуратно вернуть вставные фильтры в пластину из 12 скважин, содержащую 1,5 миллилитра теплого ECM на скважину.
Теперь вставные фильтры готовы к покрытию с другой стороны. Покройте верхнюю сторону и вставные фильтры 500 микролитрами гидрогеля на основе внеклеточного матрикса. Поместите вставные фильтры в увлажненный инкубатор при температуре 37 градусов цельсия при 5% углекислого газа и 21% кислорода в течение часа.
Мойте их один раз с 500 микролитрами высокой глюкозы DMEM при комнатной температуре. Промойте культуру эндотелиальных клеток один раз 10 миллилитрами теплого 1X PBS CMF и инкубируйте клетки двумя миллилитрами теплого трипсина. Удалите трипсин, когда клетки начнут отделяться, затем добавьте пять миллилитров теплого ECM и начните механическую диссоциацию.
Разбавьте 20 микролитров клеточной суспензии 80 микролитрами 1X PBS CMF и подсчитайте ячейки с помощью ручной счетной камеры. Засевают эндотелиальные клетки при плотности 71 500 клеток на сантиметр квадрата на предварительно закодированных вставных фильтрах в объеме 500 микролитров теплого ECM. Замените астроцитарную среду 1,5 миллилитрами теплого ECM на лунку.
Затем перенесите засеянные вставные фильтры в колодцы, содержащие астроциты. Поместите трехкультурные клеточные системы в увлажненный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия под 5% углекислого газа и 21% кислорода. Осторожно снимите среду из верхнего и нижнего отсека с помощью стеклянной пипетки, соединенной с системой аспирации.
Замените средний на теплый ECM объемом 500 микролитров в верхнем отсеке и 1,5 миллилитра в нижнем отсеке. Обновляйте среду через день до шестого дня, повторяя ту же процедуру. Наконец, поместите клетки обратно в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия под 5% углекислого газа и 21% кислорода.
Данные иммуноцитохимии подтвердили экспрессию обычных маркеров, таких как рецептор фактора роста тромбоцитов бета и Desmine для перицитов и глиальный фибриллярный кислый белок для астроцитов. Следовательно, после шести дней культивирования с перицитами и астроцитами монослой мозгоподобных эндотелиальных клеток или БЛЕК, визуализируемый с адгептным окрашиванием соединения Ve-Cadherin, демонстрирует непрерывную локализацию белков TJ CLD5 и Z-01 на границах клеток. Здесь показана параклеточная проницаемость BLECS к флуоресцентным маркерам целостности ГЭБ, флуоресцеину натрия и декстрану FITC.
Внутриклеточное накопление R123 в БЛЕКах показало значительное увеличение присутствия ингибитора эффлюксного насоса Elacridar по сравнению с контрольным состоянием при его отсутствии. Это указывает на наличие активных молекул эффлюксного насоса, а именно гликопротеина P и белка резистентности к раку молочной железы или BCRP в BLEC. Здесь показана экспрессия генов белков плотного соединения, транспортеров и рецепторов крупных молекул, нормализованных экспрессией RPLP0.
Здесь значения, превышающие единицу, соответствуют более высокой экспрессии генов в модели тройной культуры. Красная линия соответствует значению единицы, где уровень выражения двух моделей эквивалентен. Репрезентативное изображение показывает уровень белка плотного соединения белков, транспортеров, в рецепторах крупных молекул, нормализованных экспрессией бета-актина.
Оценивался перенос флуоресцентно меченых нейтральных полимерных наногелей на основе NIPAM. В нулевое время полимерные наногели помещали в люминальный отсек в концентрации 0,1 миллиграмма на миллилитр. После 24 часов инкубации 5,82% полимерных наногелей были обнаружены в аблюминальном компартменте, доказывая их способность пересекать БЛЕК.
Правильное покрытие и посев перицитов на реверсивном фильтре имеет решающее значение. Важным является поддержание стерильности и целостности структур, чтобы избежать загрязнения системы клеточных культур.
