في معظم الحالات ، لا يكون الطفرات التقليدية الموجهة نحو الموقع مناسبة لدراسة الدور الوظيفي للبرولين في البروتينات. هنا ، نقدم طريقة لدمج نظائرها البرولين كأحماض أمينية غير قانونية في البروتينات المركبة الريبوسوميا للتحقيق في دور بقايا البرولين على طي البروتين ووظيفته. استبدال البرولين بالأحماض الأمينية القياسية هو نهج محفوف بالمخاطر.
يسمح دمج نظائر البرولين بنوع من الجراحة الجزيئية. وبعبارة أخرى ، فإنه يقدم تغييرات جزيئية طفيفة للتأثير بشكل عقلاني على خصائص البروتين والتلاعب بها. نظرا لأن بقايا البرولين تلعب دورا أساسيا في استقرار سقالات البروتين ، فقد تكون تقنيتنا مفيدة لفهم الأسباب الكامنة وراء عجز طي البروتين ، والذي يكمن وراء بعض الحالات المرضية لدى البشر.
إن تغيرات البروتين الناجمة عن بدائل البرولين لها آثار على الهندسة التكنولوجية الحيوية للإنزيمات وتوفر فرصا لتعزيز ترجمة البروتين الريبوسومي أو طيه. هذه الطريقة لا تتطلب معدات خاصة وأجهزة باهظة الثمن. وينبغي توخي الحذر بشكل خاص مع خطوات البروتوكول، التي يستنفد فيها البرولين الأصلي من ثقافات الإشريكية القولونية قبل إضافة نظائرها من البرولين.
لبدء إنتاج البروتينات الفلورية مع البرولين الأصلي ، قم بتلقيح 200 ملليلتر من وسط NMM الطازج في قارورة Erlenmeyer سعة لترين مع ملليلترين من الثقافة بين عشية وضحاها. احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في اهتزاز مداري عند 220 دورة في الدقيقة لمدة 3.5 ساعات تقريبا. أثناء الحضانة ، قم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي كل 30 دقيقة.
عندما تصل الكثافة البصرية إلى 0.7 ، قم بتدوير تعليق الخلية وصب المادة الفائقة بلطف في النفايات. ثم ، اغسل الخلايا عن طريق التعليق في 50 ملليلتر من NMM البارد المثلج دون أي أحماض أمينية أو NMM بدون برولين. قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وصب السوبرناتانت في النفايات.
بعد ذلك ، أعد تعليق بيليه الخلية عن طريق السحب اللطيف في 200 ملليلتر من NMM بدون برولين واستكماله بالأمبيسلين في قارورة Erlenmeyer سعة لترين ، واحتضن الخلايا في شاكر مداري لمدة 30 دقيقة للسماح بالنضوب الكامل للبرولين. بعد الحضانة ، أضف حجما مناسبا من L-proline أو نظائرها من نظائرها من محاليل المخزون 50 ملليمولار للحصول على تركيز نهائي واحد ملليمولار في تعليق الخلية. بعد ذلك ، حث التعبير عن البروتين المستهدف عن طريق إضافة 500-micromolar IPTG من محلول مخزون أحادي المول.
عبر عن البروتين المستهدف بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري وقم بقياس الكثافة البصرية في اليوم التالي. جمع الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي وصب supernatant في النفايات. ثم ، اغسل الخلايا عن طريق السحب الدقيق في 50 ملليلتر من المخزن المؤقت المرتبط الذي يحتوي على 10٪ من الجلسرين.
قم بتدوير الخلايا مرة أخرى ، وصب السوبرناتانت ، وتخزين حبيبات الخلية في أنبوب سعة 50 ملليلتر عند 20 أو 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من الاستخدام. قبل تقييم انبعاث التألق ، قم بإجراء SDS-PAGE للتأكد من أن نقاء العينة أعلى من 95٪ ثم ، اضبط عينات كل متغير بروتين منقى على تركيز 0.3 ميكرومول ، مع أخذ قيمة الامتصاص المحسوبة عند الطول الموجي المناسب كمرجع. تأكد من أن حجم العينة النهائي التقريبي هو 200 ميكرولتر.
دع العينات المخففة تتوازن في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة ، انقل العينات إلى كوفيت كوارتز بطول سنتيمتر واحد وقم بقياس طيف الانبعاثات الفلورية للعينات باستخدام مطياف التألق. للحث على تمسخ ، قم بتخفيف عينات كل متغير بروتين عشرين ضعفا عن طريق إضافة ميكرولترين من عينات 300 ميكرومولار إلى 18 ميكرولتر من 1.11X PBS المخزن المؤقت الذي يحتوي على 8.89 من اليوريا المولية و 5.56 ملليمولار DTT.
احتضان العينات عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بتخفيف العينات 100 ضعف عن طريق إضافة 1،980 ميكرولتر من PBS تحتوي على DTT خمسة ملليمولات للحث على إعادة التشبع ونقل 200 ميكرولتر من العينات على الفور إلى كوفيت كوارتز بطول سنتيمتر واحد. أدخل كوفيت الكوارتز في مطياف التألق المناسب وراقب إعادة طي البروتين عن طريق الحصول على طيف التألق كل ثلاث ثوان على مدار 30 دقيقة.
انقل العينات القابلة لإعادة الطي إلى أنابيب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر، ثم أغلق الغطاء وخزن العينات في درجة حرارة الغرفة في الظلام للسماح بإعادة الطي الكامل لمتغيرات EGFP. بعد 24 ساعة ، قم بقياس انبعاث التألق لعينات البروتين المطوية باستخدام نفس الطول الموجي للإثارة كما كان من قبل لالتقاط نقطة النهاية الزمنية لاستعادة التألق. الكريات من الخلايا التي تعبر عن البروتين الأصلي والمتغيرات التي تحمل S-fluoroproline و dehydroproline كان لها لون مشرق نموذجي بسبب الكروموفور السليم.
في المقابل ، ظلت المتغيرات التي تحتوي على R-fluoroproline و difluoroproline عديمة اللون ، مما يشير إلى سوء الطي وترسب البروتين غير المطوي في أجسام التضمين. تحقق تحليل SDS-PAGE من وجود بروتينات غير قابلة للذوبان تحتوي على R-fluoroproline. في المقابل ، تم العثور على البروتينات الأصلية والمتغيرات الحاملة ل S-fluoroproline و dehydroproline في الكسور القابلة للذوبان.
في تحليل الكروماتوغرافيا السائلة / قياس الطيف الكتلي ، أنتج كل استبدال للبرولين مع S-fluoroproline تحولا إيجابيا بمقدار 18 دالتون لكل بقايا برولين ، في حين أن الاستبدال ب dehydroproline أنتج تحولا سلبيا قدره دالتون اثنين لكل بقايا. في أطياف امتصاص الضوء والانبعاثات ، تم العثور على امتصاص الكروموفور عند 488 نانومتر ل EGFP و 493 نانومتر ل NowGFP. في KillerOrange ، تتكون منطقة امتصاص الكروموفور من نطاقين يقابلان حالتين تكوينيتين وشحنتين محتملتين للكروموفور المعقد.
وعلاوة على ذلك، فإن أطياف التألق المسجلة عند الإثارة عند الأطوال الموجية القصوى المقابلة للامتصاص تعني ضمنا أن نظائرها لا تغير البيئة الكيميائية للكروموفورات. في تجارب إعادة الطي ، تعافى تألق كروموفور EGFP الأصلي جزئيا ، على الرغم من أن التألق الخاص بالتريبتوفان كان أكبر بعد إعادة التشبع. لوحظ سلوك مماثل للمتغير الذي يحتوي على ديهيدروبرولين.
في EGFP المحتوي على S-fluoroproline ، لوحظت نتيجة مماثلة مع إثارة 295 نانومتر ، في حين تعافى التألق إلى حد أعلى بكثير عند 488 نانومتر. فقط متغيرات EGFP أظهرت حركية سريعة الطي مع استعادة انبعاثات التربتوفان أسرع مرتين مقارنة بانبعاث الكروموفور. يجب استخدام الثقافات البكتيرية الطازجة ذات وسائط النمو المناسبة.
التقنيات المعقمة والرصد المنتظم لنمو الثقافة هي أيضا شروط مسبقة مهمة لنجاح التجربة. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على هندسة البروتين ، لأنها تسمح بدراسة دور الأحماض الأمينية الأساسية الأخرى. لهذا ، هناك حاجة إلى سلالات E.coli auxotrophic المناسبة ونظائرها من الأحماض الأمينية.
مطلوب قياس الطيف الكتلي للبروتينات الكاملة كدليل تحليلي لتأكيد دمج نظائرها من الأحماض الأمينية غير القانونية. تسمح لنا طريقة SPI لدمج نظائرها البرولين بالتعامل مع العمود الفقري للبروتين مباشرة ، وتوفر مزايا للتصميم العقلاني وتسهيل إنتاج البروتينات من خلال الاستقرار العالمي وتحسين الترجمة الريبوسومية أو الطي.
