تحليل الببتيدات الذاتية المنشأ ، والتي هي أصغر من معظم البروتينات ، ولكنها أكبر من العديد من الببتيدات المهضومة هو مجال قيد الفحص. يعالج هذا البروتوكول الغطاء في مهام سير العمل القائمة على قياس الطيف الكتلي. قياس الطيف الكتلي حساس للغاية ويمكن استخدامه لاستهداف ببتيدات نيوروببتيدات محددة ذات أهمية أو يمكنه التقاط واكتشاف مجموعة من الببتيدات العصبية داخل العينة.
يمكن أن يؤدي تحديد كمية وتوطين تعبير الببتيد النيوروبي بواسطة قياس الطيف الكتلي إلى تطوير علاجات الببتيد واكتشاف المؤشرات الحيوية للببتيد النيوروبيبتيد لمختلف الأمراض. لبدء استخراج neuropeptide جمع أنسجة المخ من القشريات واستخدام ملقط على الفور وضع نسيج واحد لكل منها في أنبوب 0.6 ملليلتر يحتوي على 20 ميكرولتر من الميثانول المحمض. أضف 150 ميكرولتر من الميثانول المحمض إلى العينة.
اضبط إجمالي وقت مريض سونيك على 24 ثانية ، ووقت النبض على ثماني ثوان. توقف مؤقتا إلى 15 ثانية سعة إلى 50٪ على مجانس بالموجات فوق الصوتية وتجانس العينات على الجليد. الطرد المركزي للعينة عند أربع درجات مئوية عند 20،000 GS لمدة 20 دقيقة.
باستخدام ماصة ، تم نقل المادة الفائقة إلى أنبوب وتجفيفها في مكثف فراغ عند حوالي 35 درجة مئوية. لإزالة الملح ، أعد تكوين عينة الأنسجة المستخرجة في 20 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1٪. دوامة الحل وسونيكات في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
ضع 0.5 ميكرولتر من العينة على شريط الأس الهيدروجيني للتأكد من أن الرقم الهيدروجيني أقل من أربعة. جهاز طرد مركزي عند أربع درجات مئوية و 20،000 GS لمدة 30 ثانية. تحضير غسل توازن الترطيب في حلول الوهم.
احصل على طرف تحلية 10 ميكرولتر باستخدام راتنج C18. ضع طرف تحلية المياه على ماصة سعة 20 ميكرولتر تم ضبطها على 15 ميكرولتر. قم بشفط الطرف ثلاث مرات باستخدام محلول الترطيب وثلاث مرات باستخدام حل التعاون المتساوي.
الشفط في العينة 10 مرات متبوعا بالغسيل ثلاث مرات في محلول الغسيل مع التخلص من كل غسلة. Elute عن طريق الشفط 10 مرات في كل من حلول الوهم من أجل زيادة Acetonitrile. جفف الببتيدات العصبية المشار إليها في مكثف فراغ.
إعادة تشكيل الببتيدات العصبية المملحة المجففة في خمسة ميكرولترات من 0.1٪ من حمض الفورميك. دوامة الحل وصوتنة في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة في 2000 GS. لاكتشاف الببتيدات العصبية وأنسجة القشرة، قم بماصة قطرة من العينة سعة ثلاثة ميكرولترات على فيلم مسعور.
ماصة ثلاثة ميكرولترات من مصفوفة DHB مباشرة على قطرة العينة. امزج الحلول عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. ماصة ميكرولتر واحد من خليط العينة والمصفوفة في بئر من لوحة الهدف من الفولاذ المقاوم للصدأ MALDI واستخدام طرف الماصة لنشر كل خليط إلى حواف العينة جيدا.
ضع ميكرولتر واحد من خليط العيار والمصفوفة في بئر بالقرب من العينة. أدخل لوحة الهدف التي تحتوي على بقع عينة مجففة في أداة وقت الطيران الترادف MALDI. مع مصفوفة DHB تعيين قوة الليزر إلى 95٪ حدد التلقائي الأمثل كاشف كسب والذكية عينة كاملة وضع حركة الناقل عينة.
احصل على MS Spectra في نطاق 200 إلى 3 ، 200 M على Z وأضف أطياف متعددة من كل بقعة معا لزيادة نسبة إشارة neuropeptide إلى الضوضاء. املأ نصف كوب كريوستات بالجيلاتين واتركه يتصلب في درجة حرارة الغرفة. حافظ على بقايا الجيلاتين السائل دافئا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
جمع الأنسجة العصبية المطلوبة من الحيوان واستخدام ملقط لغمس الأنسجة على الفور في أنبوب 0.6 ملليلتر يحتوي على الماء منزوع الأيونات لمدة ثانية واحدة. ضع الأنسجة فوق الجيلاتين الصلب واملأ بقية كوب cryostat بالجيلاتين السائل. استخدم الملقط لوضع الأنسجة.
ضع كوب cryostat على سطح مستو وقم بتجميده بالثلج الجاف. لإعداد التقسيم ، افصل عينة الجيلاتين المضمنة عن قالب cryostat عن طريق قطع القالب بعيدا. قم بتركيب الأنسجة المدمجة على تشاك cryostat عن طريق سحب قطرة ملليلتر واحدة من الماء منزوع الأيونات على الظرف والضغط على الفور على الأنسجة المضمنة على القطرة.
بمجرد تجميد الماصة ، المزيد من الماء منزوع الأيونات حول الأنسجة لزيادة تأمينها إلى تشاك. قسم الأنسجة بسماكة تقريبية لخلية واحدة. قم بتركيب كل قسم على شريحة زجاجية مغلفة بأكسيد القصدير الإنديوم عن طريق وضع جانب واحد من الشريحة بالقرب من القسم ووضع إصبع على الجانب الآخر من الشريحة لتسخين الزجاج ببطء والسماح للقسم بالالتصاق بالشرائح.
تصدير دي نوفو الببتيدات فقط. CSV من قمم بمتوسط درجة ثقة محلية أكبر من أو يساوي 75. ابحث في قائمة الببتيد عن زخارف التسلسل المعروفة التي تشير إلى الببتيدات العصبية التي تنتمي إلى عائلات محددة من الببتيد النيوروبيبتيد.
اختر تسلسل معروف من الأحماض الأمينية لهرمون ما قبل برو واستخدم TB blast N للبحث عن تسلسل هرمون ما قبل المحترفين مقابل قاعدة بيانات. حدد الكائن الحي المستهدف وقم بتغيير معلمات خوارزمية العتبة المتوقعة إلى 1000 لتشمل محاذاة منخفضة الدرجات. قم بتشغيل برنامج الانفجار ثم تحقق من النتائج للحصول على درجات تماثل عالية بين الاستعلام وتسلسلات الموضوع التي تنتج محاذاة كبيرة.
احفظ ملف FASTA الذي يحتوي على تسلسل النيوكليوتيدات. ترجمة تسلسل النيوكليوتيدات الهرمونية قبل برو إلى تسلسلات الببتيد الهرمونية قبل برو باستخدام أداة ترجمة إكسباسي. بالنسبة ل callinectes sapidus ، حدد الميتوكوندريا اللافقارية للشفرة الوراثية وقم بتشغيل الأداة.
تحقق من تسلسل الببتيد المرجعي ومواقع انقسام الهرمونات الاحترافية في تسلسل الببتيد باستخدام الإشارة P.This هو طيف تجزئة ل neuropeptide تم تحديده مع تغطية تسلسل 100٪ في خطأ كتلة شظية منخفض مع حد أقصى قدره 0.02 Dalton. هنا طيف من neuropeptide تم تحديده أيضا بتغطية تسلسل 100٪ ، ولكن مع عدد قليل من أيونات الشظايا ، وبالتالي فإن ثقة التعريف منخفضة. هذه هي كروماتوجرامات الأيونات المستخرجة لببتيد نيوروببتيد واحد تم تحديده في شوطين منفصلين ومتتاليين.
على الرغم من أن وقت الاحتفاظ يختلف قليلا ، إلا أنه لا يزال من الممكن استخدامه للقياس الكمي بدون تسمية لأن تحول الوقت أقل من دقيقة واحدة. هذا مثال على طيف كتلة مسح كامل يحتوي على نيوروببتيد تم تصنيفه على ثنائي ميثيل مما أدى إلى تحول كتلة دالتون 4.025 بين الأشكال الخفيفة والثقيلة من الببتيد العصبي. يوضح طيف كتلة أيون الشظايا لببتيد De Novo المتسلسل تغطية جيدة للتجزئة ، حيث لوحظ أيون الشظايا B و أو Y لكل حمض أميني مع خطأ كتلة منخفض قدره 0.02 Dalton.
هذا يشير إلى أنه لوحظ وجود ببتيد داخلي ينتمي إلى عائلة القشريات RYMI neuropeptide. تظهر أمثلة على البقع الجيدة التي تلمس جميع حواف نقش البئر على اليسار. وتظهر أمثلة على البقع السيئة على اليمين.
بعد تصوير MALDI MS للببتيدات العصبية من أنسجة callinectes sapidus ، تم الحصول على صور توزيع الأيونات لمختلف قيم M على Z المقابلة لمختلف الببتيدات neuropeptides. يعد تحسين مذيب الاستخراج لنوع تحليلي معين أمرا بالغ الأهمية. تأكد أيضا من حدوث التجانس الكامل وضبط الطريقة حسب الحاجة.
لن يتم الكشف عن أي شيء في اتجاه المصب إذا لم يتم استخراجه. يمكن أن توفر هذه التقنية قائمة تأسيسية من الببتيدات العصبية المهمة التي يمكن التحقيق فيها بشكل أكبر كمؤشرات حيوية محتملة ، بالإضافة إلى توفير معلومات توطين غير مستهدفة دون الحاجة إلى أجسام مضادة.
