Çoğu proteinden daha küçük, ancak birçok sindirilmiş peptitten daha büyük olan endojen peptitlerin analizi, incelenen bir alandır. Bu protokol, kütle spektrometresi tabanlı iş akışlarında scap'i ele alır. Kütle spektrometresi oldukça hassastır ve ilgilenilen spesifik nöropeptitleri hedeflemek için kullanılabilir veya bir numune içindeki bir dizi nöropeptiti yakalayabilir ve tespit edebilir.
Nöropeptit ekspresyonunun kütle spektrometrisi ile kantitasyonu ve lokalizasyonu, peptid terapötiklerinin gelişmesine ve çeşitli hastalıklar için nöropeptit biyobelirteçlerinin keşfine yol açabilir. Nöropeptit ekstraksiyonuna başlamak için kabuklulardan beyin dokusu toplayın ve forseps kullanarak hemen her biri 20 mikrolitre asitlenmiş metanol içeren 0.6 mililitrelik bir tüpe bir doku yerleştirin. Numuneye 150 mikrolitre asitlenmiş metanol ekleyin.
Toplam Sonic hasta süresini 24 saniyeye, nabız süresini sekiz saniyeye ayarlayın. Ultrasonik homojenizatörde% 50'ye kadar bir genliği 15 saniyeye kadar duraklatın ve buz üzerindeki örnekleri homojenleştirin. Numuneyi 20 dakika boyunca 20.000 GS'de dört santigrat derecede santrifüj yapın.
Bir pipet ile süpernatantı bir tüpe aktarın ve yaklaşık 35 santigrat derecede bir vakum yoğunlaştırıcıda kurutun. Tuzdan arındırma için, ekstrakte edilen doku numunesini 20 mikrolitre% 0.1 formik asit içinde yeniden oluşturun. Çözeltiyi vorteks edin ve bir dakika boyunca oda sıcaklığında bir su banyosunda sonikat yapın.
PH'ın dörtten az olduğunu doğrulamak için bir pH şeridine 0,5 mikrolitre numune uygulayın. 30 saniye boyunca dört santigrat derece ve 20.000 GS'de santrifüj. İllüzyon çözeltilerinde ıslatma dengeleme yıkaması hazırlayın.
C18 reçine ile 10 mikrolitrelik bir tuz giderme ucu elde edin. Tuz alma ucunu 15 mikrolitreye ayarlanmış 20 mikrolitrelik bir pipete yerleştirin. Ucu ıslatma çözeltisiyle üç kez ve eşit işbirliği çözümüyle üç kez aspire edin.
Numunede 10 kez aspirasyon yapın, ardından her yıkamayı atarak yıkama çözeltisinde üç kez yıkayın. Asetonitril'i arttırmak için illüzyon çözeltilerinin her birinde 10 kez aspire ederek süle edin. İma edilen nöropeptitleri bir vakum konsantratöründe kurutun.
Kurutulmuş tuzdan arındırılmış nöropeptitleri% 0.1 formik asitten oluşan beş mikrolitre içinde yeniden oluşturur. Çözeltiyi vorteks edin ve bir dakika boyunca oda sıcaklığında bir su banyosunda sonikleştirin. 2000 GS'de kısaca santrifüj. Nöropeptitlerin ve kabuk dokularının lekelenmesi için, hidrofobik bir film üzerine üç mikrolitrelik bir numune damlacığı pipetin.
Doğrudan numune damlacığı üzerinde üç mikrolitre DHB matrisi pipetin. Çözeltileri yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın. Numunenin bir mikrolitresini ve matris karışımını MALDI paslanmaz çelik hedef plakasının bir kuyucuğuna pipetleyin ve her karışımı numune kuyusunun kenarlarına yaymak için pipet ucunu kullanın.
Bir mikrolitre bire bir kalibre ve matris karışımını numunenin yakınındaki bir kuyuya yerleştirin. Kurutulmuş numune noktaları içeren hedef plakayı MALDI tandem uçuş süresi cihazına yerleştirin. DHB matrisi ile lazer gücünü% 95'e ayarlayın Otomatik optimum dedektör kazancını ve akıllı komple numune taşıyıcı hareket modunu seçin.
MS Spektrumlarını Z üzerinden 200 ila 3.200 M aralığında elde edin ve nöropeptit sinyalini gürültü oranına yükseltmek için her noktadan çoklu spektrumları bir araya getirin. Yarım kriyostat bardağını jelatinle doldurun ve oda sıcaklığında katılaşmasını bekleyin. Artık sıvı jelatini 37 santigrat derece su banyosunda sıcak tutun.
İstenilen nöronal dokuyu hayvandan toplayın ve dokuyu derhal bir saniye boyunca deiyonize su içeren 0.6 mililitrelik bir tüpe batırmak için forseps kullanın. Dokuyu katı jelatinin üzerine yerleştirin ve kriyostat kabının geri kalanını sıvı jelatinle doldurun. Dokuyu konumlandırmak için forseps kullanın.
Kriyostat kabını düz bir yüzeye yerleştirin ve kuru buzla dondurun. Kesitleme hazırlığı için, jelatin gömülü numuneyi, kalıbı keserek kriyostat kalıbından ayırın. Gömülü dokuyu, bir mililitrelik deiyonize su damlacığını mandren üzerine pipetleyerek ve gömülü dokuyu hemen damlacık üzerine bastırarak bir kriyostat mandren üzerine monte edin.
Dondurulmuş pipet bir kez, mandrene daha fazla sabitlemek için dokunun etrafında daha fazla deiyonize su. Dokuyu bir hücrenin yaklaşık kalınlığında kesitleyin. Başparmak, slaytın bir tarafını bölümün yanına yerleştirerek ve camı yavaşça ısıtmak ve bölümün slayda yapışmasını sağlamak için parmağınızı slaytın diğer tarafına yerleştirerek her bölümü İndiyum kalay oksit kaplı bir cam slayt üzerine monte edin.
De Novo sadece peptitleri ihraç edin. Ortalama yerel güven puanı 75'ten büyük veya ona eşit olan zirvelerden CSV. Belirli nöropeptit ailelerine ait nöropeptitlerin göstergesi olan bilinen dizi motifleri için peptid listesini arayın.
İlgilendiğiniz bilinen bir pro-pro öncesi hormon amino asit dizisini seçin ve bir veritabanına karşı pro-pro öncesi hormon dizisini sorgulamak için TB blast N'yi kullanın. Hedef organizmayı seçin ve düşük puan hizalamalarını içerecek şekilde beklenen eşik algoritması parametrelerini 1000 olarak değiştirin. Patlama programını çalıştırın ve ardından önemli hizalamalar üreten sorgu ve konu dizileri arasında yüksek homoloji puanları için sonuçları kontrol edin.
Nükleotid dizisini içeren FASTA dosyasını kaydedin. Expasy çeviri aracını kullanarak pro-pro öncesi hormon nükleotid dizisini pro-öncesi hormon peptid dizilerine çevirin. Callinectes sapidus için genetik kod için omurgasız mitokondriyal seçin ve aracı çalıştırın.
Sinyal P.Bu, maksimum 0.02 Dalton limiti olan düşük bir fragman kütle hatasında% 100 dizi kapsamı ile tanımlanan bir nöropeptidin parçalanma spektrumudur. Burada% 100 sekans kapsamı ile de tanımlanan bir nöropeptitin spektrumu, ancak düşük sayıda fragman iyonu ile, bu nedenle tanımlamanın güveni düşüktür. Bunlar, iki ayrı ve ardışık çalışmada tanımlanan tek bir nöropeptit için ekstrakte edilen iyon kromatogramlarıdır.
Saklama süresi biraz farklı olsa da, zaman kayması bir dakikadan az olduğu için etiketsiz niceleme için bu hala kullanılabilir. Bu, nöropeptidin hafif ve ağır formları arasında 4.025 Dalton kütle kayması ile sonuçlanan Dimetil etiketli bir nöropeptit içeren tam tarama kütle spektrumunun bir örneğidir. Bir De Novo dizili peptidin fragman iyonu kütle spektrumu, 0.02 Dalton'luk düşük bir kütle hatasıyla her amino asit için B ve veya Y fragman iyonunun gözlendiği iyi parçalanma kapsamını gösterir.
Bu, kabuklu RYMI nöropeptit ailesine ait endojen bir peptidin gözlendiğini göstermektedir. Kuyu gravürünün tüm kenarlarına dokunan iyi noktaların örnekleri solda gösterilmiştir. Ve kötü noktaların örnekleri sağda gösterilmiştir.
Kalinectes sapidus dokularından nöropeptitlerin MALDI MS görüntülemesinden sonra, farklı nöropeptitlere karşılık gelen çeşitli M over Z değerlerinin iyon dağılım görüntüleri elde edildi. Belirli bir analiz tipi için ekstraksiyon çözücü optimizasyonu çok önemlidir. Ayrıca tam homojenizasyonun gerçekleştiğinden emin olun ve yöntemi gerektiği gibi ayarlayın.
Çıkarılmazsa aşağı yönde hiçbir şey algılanmaz. Bu teknik, potansiyel biyobelirteçler olarak daha fazla araştırılabilecek önemli nöropeptitlerin temel bir listesini sağlayabilir ve ayrıca antikorlara ihtiyaç duymadan hedeflenmemiş lokalizasyon bilgisi sağlayabilir.
