ほとんどのタンパク質よりも小さいが、多くの消化ペプチドよりも大きい内因性ペプチドの分析は、未検討の分野である。このプロトコルは、質量分析ベースのワークフローにおけるscapに対処します。質量分析は非常に高感度であり、目的の特定の神経ペプチドを標的にするために使用したり、サンプル内の神経ペプチドの範囲を捕捉して検出することができます。
質量分析による神経ペプチド発現の定量および局在化は、ペプチド治療薬の開発および様々な疾患に対する神経ペプチドバイオマーカーの発見につながる可能性がある。神経ペプチド抽出を開始するには、甲殻類から脳組織を収集し、鉗子を使用して直ちに1つの組織を20マイクロリットルの酸性化メタノールを含む0.6ミリリットルのチューブに入れる。150マイクロリットルの酸性化メタノールをサンプルに加える。
ソニック患者の合計時間を24秒、パルス時間を8秒に設定します。超音波ホモジナイザーで振幅を50%に15秒に一時停止し、氷上でサンプルを均質化します。サンプルを摂氏 4 度で 20, 000 GS で 20 分間遠心分離します。
ピペットで上清をチューブに移し、約35°Cの真空濃縮器で乾燥させた。脱塩のために、抽出した組織試料を20マイクロリットルの0.1%ギ酸で再構成する。溶液を渦巻き、室温の水浴中で1分間超音波処理する。
0.5マイクロリットルのサンプルをpHストリップに塗布して、pHが4未満であることを確認します。摂氏 4 度と 20, 000 GS で 30 秒間遠心分離します。錯覚溶液中で濡れ平衡洗浄を準備する。
10マイクロリットルの脱塩チップをC18樹脂で得た。脱塩チップを、15 マイクロリットルに設定された 20 マイクロリットルのピペットの上に置きます。先端を濡れ溶液で3回、等コラボレーション溶液で3回吸引します。
試料を10回吸引し、続いて各洗浄液を捨てて洗浄液で3回洗浄した。アセトニトリルを増加させる順にそれぞれの錯覚溶液で10回吸引して溶出する。ほのめかした神経ペプチドを真空濃縮器で乾燥させる。
乾燥脱塩した神経ペプチドを5マイクロリットルの0.1%ギ酸で再構成する。溶液を渦巻き、室温の水浴中で1分間超音波処理する。2000 GSで短時間遠心分離機。神経ペプチドおよびクラスタ組織のスポッティングのために、疎水性フィルム上に3マイクロリットルのサンプル液滴をピペットで留める。
3マイクロリットルのDHBマトリックスをサンプル液滴上に直接ピペットする。上下にピペッティングして溶液を混ぜる。サンプルおよびマトリックス混合物の1マイクロリットルをMALDIステンレス鋼ターゲットプレートのウェルにピペットし、ピペットチップを使用して各混合物をサンプルウェルの縁に広げる。
1マイクロリットルの1対1口径とマトリックス混合物をサンプルの近くのウェルにスポットします。乾燥したサンプルスポットを含むターゲットプレートをMALDIタンデム飛行時間計器に挿入します。DHBマトリックスを使用すると、レーザー出力を95%に設定し、自動最適検出器ゲインとスマートな完全なサンプルサンプルキャリア移動モードを選択します。
Zに対して200~3、200 Mの範囲のMSスペクトルを取得し、各スポットから複数のスペクトルを一緒に追加して、神経ペプチドのシグナル対ノイズ比を高めます。クライオスタットカップの半分にゼラチンを入れ、室温で固化させます。残った液体ゼラチンを摂氏37度の水浴中で温かく保ちます。
動物から所望のニューロン組織を収集し、鉗子を使用して、脱イオン水を含む0.6ミリリットルのチューブに直ちに組織を1秒間浸漬する。固体ゼラチンの上に組織を置き、クライオスタットカップの残りの部分を液体ゼラチンで満たします。鉗子を使用して組織を配置します。
クライオスタット カップを平らな面に置き、ドライアイスで凍らせます。切片化調製のために、ゼラチン包埋サンプルを金型を切断することによってクライオスタットモールドから分離する。1ミリリットルの脱イオン水の液滴をチャックにピペッティングし、直ちに埋め込み組織を液滴に押し付けることによって、埋め込み組織をクライオスタットチャックに取り付ける。
一旦ピペットを凍結したら、組織周辺の脱イオン水をさらに多くし、さらにチャックに固定する。1つの細胞のおおよその厚さで組織を切開する。スライドの片側をセクションの近くに置き、スライドの反対側に指を置いてガラスをゆっくりと温め、セクションをスライドに貼り付けることで、各セクションをインジウムスズ酸化物コーティングされたスライドガラスに親指で取り付けます。
デノボのみのペプチドを輸出する。平均ローカル信頼度スコアが 75 以上のピークからの CSV。特定の神経ペプチドファミリーに属する神経ペプチドを示す既知の配列モチーフについてペプチドリストを検索する。
目的の既知のプレプロホルモンアミノ酸配列を選択し、TB blast Nを使用して、データベースに対してクエリプレプロホルモン配列を検索します。ターゲット オーガニゼーションを選択し、期待しきい値アルゴリズム パラメーターを 1000 に変更して、低スコアのアラインメントを含めます。blast プログラムを実行し、クエリ配列と被験者配列の間で高い相同性スコアがないか結果をチェックし、有意なアライメントを生成します。
塩基配列を含むFASTAファイルを保存します。Expasy翻訳ツールを使用して、プレプロホルモンのヌクレオチド配列をプレプロホルモンペプチド配列に翻訳します。カリネクテス・サピドゥスの場合、遺伝暗号のために無脊椎動物のミトコンドリアを選択し、ツールを実行します。
シグナルP.Thisを使用してペプチド配列中のシグナルペプチド配列およびプロホルモン切断部位をチェックするこれは、0.02ダルトンの最大限界を有する低フラグメント質量誤差で100%配列カバレッジで同定された神経ペプチドの断片化スペクトルである。ここには、100%の配列カバレッジで同定されたニューロペプチドのスペクトルがあるが、断片イオンの数が少ないため、同定の信頼性は低い。これらは、2つの別々の連続した実行で同定された単一の神経ペプチドについて抽出されたイオンクロマトグラムである。
保持時間はわずかに異なりますが、時間シフトは1分未満であるため、これはラベルフリー定量に使用できます。これは、ジメチル標識されたニューロペプチドを含むフルスキャンマススペクトルの例であり、その結果、ニューロペプチドの軽質型と重型の間に4.025ダルトンの質量シフトが生じる。De Novo配列決定ペプチドのフラグメントイオンマススペクトルは、良好なフラグメント化カバレッジを示し、BおよびまたはYフラグメントイオンは、0.02ダルトンの低い質量誤差で各アミノ酸について観察された。
このことは、甲殻類RYMI神経ペプチドファミリーに属する内因性ペプチドが観察されたことを示している。井戸彫刻のすべての端に触れる良い斑点の例を左側に示します。そして、悪い点の例を右側に示します。
カリネクテス・サピダス組織由来の神経ペプチドのMALDIMSイメージング後、異なる神経ペプチドに対応する様々なMーZ値のイオン分布画像が得られた。特定の分析タイプに対する抽出溶媒の最適化は非常に重要です。また、完全な均質化が行われることを確認し、必要に応じて方法を調整します。
抽出されていない場合、下流では何も検出されません。この技術は、潜在的なバイオマーカーとしてさらに調査することができる重要な神経ペプチドの基礎リストを提供するだけでなく、抗体を必要とせずに非標的局在化情報を提供することができる。
