L’analyse des peptides endogènes, qui sont plus petits que la plupart des protéines, mais plus grands que de nombreux peptides digérés, est un domaine sous-examiné. Ce protocole traite le scap dans les flux de travail basés sur la spectrométrie de masse. La spectrométrie de masse est très sensible et peut être utilisée pour cibler des neuropeptides spécifiques d’intérêt ou peut capturer et détecter une gamme de neuropeptides dans un échantillon.
La quantification et la localisation de l’expression des neuropeptides par spectrométrie de masse peuvent conduire au développement de thérapies peptidiques et à la découverte de biomarqueurs neuropeptides pour diverses maladies. Pour commencer l’extraction des neuropeptides, prélevez le tissu cérébral du crustacé et, à l’aide de pinces, placez immédiatement un tissu chacun dans un tube de 0,6 millilitre contenant 20 microlitres de méthanol acidifié. Ajouter 150 microlitres de méthanol acidifié à l’échantillon.
Réglez le temps total du patient Sonic sur 24 secondes, le temps d’impulsion sur huit secondes. Temps de pause à 15 secondes et amplitude à 50% sur un homogénéisateur à ultrasons et homogénéiser les échantillons sur la glace. Centrifuger l’échantillon à quatre degrés Celsius à 20 000 GS pendant 20 minutes.
Avec une pipette, transférez le surnageant dans un tube et séchez-le dans un concentrateur sous vide à environ 35 degrés Celsius. Pour le dessalement reconstituer l’échantillon de tissu extrait dans 20 microlitres d’acide formique à 0,1%. Vortex la solution et sonicate dans un bain-marie à température ambiante pendant une minute.
Appliquez 0,5 microlitre d’échantillon sur une bande de pH pour confirmer que le pH est inférieur à quatre. Centrifuger à quatre degrés Celsius et 20 000 GS pendant 30 secondes. Préparez un lavage d’équilibrage mouillant dans des solutions d’illusion.
Obtenez une pointe de dessalement de 10 microlitres avec de la résine C18. Placez la pointe de dessalage sur une pipette de 20 microlitres réglée sur 15 microlitres. Aspirer la pointe trois fois avec une solution de mouillage et trois fois avec une solution de collaboration équique.
Aspirer dans l’échantillon 10 fois suivi d’un lavage trois fois en solution de lavage en jetant chaque lavage. Éluez en aspirant 10 fois dans chacune des solutions d’illusion dans l’ordre d’augmenter l’acétonitrile. Sécher les neuropeptides évoqués dans un concentrateur sous vide.
Reconstituer les neuropeptides dessalés séchés dans cinq microlitres d’acide formique à 0,1%. Vortex la solution et sonique dans un bain-marie à température ambiante pendant une minute. Centrifuger brièvement à 2000 GS. Pour repérer les neuropeptides et les tissus de la croûte, pipeter une gouttelette d’échantillon de trois microlitres sur un film hydrophobe.
Pipette trois microlitres de matrice DHB directement sur la gouttelette d’échantillon. Mélangez les solutions en pipetant de haut en bas. Pipette un microlitre de l’échantillon et du mélange matriciel dans un puits de la plaque cible en acier inoxydable MALDI et utiliser la pointe de la pipette pour étaler chaque mélange sur les bords du puits d’échantillonnage.
Repérez un microlitre de calibre un à un et un mélange matriciel dans un puits près de l’échantillon. Insérez la plaque cible contenant des points d’échantillon séchés dans l’instrument de temps de vol tandem MALDI. Avec la matrice DHB, réglez la puissance laser à 95 %, sélectionnez le gain optimal automatique du détecteur et le mode de mouvement intelligent du porte-échantillon complet.
Acquérir des spectres MS dans la gamme de 200 à 3, 200 M sur Z et ajouter plusieurs spectres de chaque point ensemble pour augmenter le rapport signal neuropeptide sur bruit. Remplissez la moitié d’une tasse de cryostat avec de la gélatine et laissez-la se solidifier à température ambiante. Gardez les restes de gélatine liquide au chaud dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.
Prélevez le tissu neuronal souhaité de l’animal et utilisez une pince pour plonger immédiatement le tissu dans un tube de 0,6 millilitre contenant de l’eau désionisée pendant une seconde. Placez le tissu sur la gélatine solide et remplissez le reste de la tasse de cryostat avec de la gélatine liquide. Utilisez des pinces pour positionner le tissu.
Placez la tasse de cryostat sur une surface plane et congelez-la avec de la glace carbonique. Pour la préparation du sectionnement, séparez l’échantillon de gélatine incorporée du moule de cryostat en coupant le moule. Montez le tissu incorporé sur un mandrin de cryostat en pipetant une gouttelette d’eau désionisée d’un millilitre sur le mandrin et en pressant immédiatement le tissu incorporé sur la gouttelette.
Une fois la pipette congelée, plus d’eau désionisée autour du tissu pour le fixer davantage au mandrin. Coupez le tissu à une épaisseur approximative d’une cellule. Montez chaque section sur une lame en verre revêtue d’oxyde d’indium-étain en plaçant un côté de la glissière près de la section et en plaçant un doigt de l’autre côté de la glissière pour réchauffer lentement le verre et permettre à la section de coller à la glissière.
Exportez De Novo uniquement des peptides. CSV à partir de pics avec un score de confiance local moyen supérieur ou égal à 75. Recherchez dans la liste des peptides des motifs de séquence connus indiquant des neuropeptides appartenant à des familles de neuropeptides spécifiques.
Choisissez une séquence d’acides aminés pré-pro hormone connue d’intérêt et utilisez TB blast N pour rechercher une séquence d’hormones pré-pro dans une base de données. Sélectionnez l’organisme cible et modifiez les paramètres de l’algorithme de seuil attendus à 1000 pour inclure des alignements de score faible. Exécutez le programme blast, puis vérifiez les résultats pour des scores d’homologie élevés entre les séquences de requête et de sujet produisant des alignements significatifs.
Enregistrez le fichier FASTA contenant la séquence nucléotidique. Traduire la séquence nucléotidique de l’hormone pré-pro en séquences peptidiques de l’hormone pré-pro à l’aide de l’outil de traduction Expasy. Pour callinectes sapidus sélectionnez invertébré mitochondrial pour le code génétique et exécutez l’outil.
Vérifiez la séquence peptidique du signal et les sites de clivage de l’hormone pro dans les séquences peptidiques à l’aide du signal P.Il s’agit d’un spectre de fragmentation d’un neuropeptide identifié avec une couverture de séquence de 100% dans une erreur de masse de fragment faible avec une limite maximale de 0,02 Dalton. Voici un spectre d’un neuropeptide également identifié avec une couverture de séquence de 100%, mais avec un faible nombre d’ions fragments, donc la confiance de l’identification est faible. Ce sont les chromatogrammes ioniques extraits pour un seul neuropeptide qui a été identifié en deux séries distinctes et consécutives.
Même si le temps de rétention diffère légèrement, il peut toujours être utilisé pour la quantification sans étiquette car le décalage temporel est inférieur à une minute. Ceci est un exemple d’un spectre de masse de balayage complet contenant un neuropeptide qui a été marqué Diméthyle, ce qui a entraîné un changement de masse de Dalton de 4,025 entre les formes légères et lourdes du neuropeptide. Le spectre de masse ionique fragmentaire d’un peptide séquencé De Novo démontre une bonne couverture de fragmentation, où l’ion fragment B et ou Y a été observé pour chaque acide aminé avec une erreur de masse faible de 0,02 Dalton.
Cela indique qu’un peptide endogène appartenant à la famille des neuropeptides RYMI des crustacés a été observé. Des exemples de bons points qui touchent tous les bords de la gravure du puits sont montrés à gauche. Et des exemples de mauvais points sont montrés à droite.
Après l’imagerie MALDI MS de neuropeptides de tissus callinectes sapidus, des images de distribution ionique de diverses valeurs M sur Z ont été obtenues correspondant à différents neuropeptides. L’optimisation des solvants d’extraction pour un type d’analyse particulier est cruciale. Assurez-vous également que l’homogénéisation complète se produit et ajustez la méthode au besoin.
Rien ne sera détecté en aval s’il n’est pas extrait. Cette technique peut fournir une liste fondamentale de neuropeptides importants qui peuvent être étudiés plus avant en tant que biomarqueurs potentiels, ainsi que fournir des informations de localisation non ciblées sans avoir besoin d’anticorps.
