대부분의 단백질보다 작지만 많은 소화 된 펩티드보다 큰 내인성 펩티드의 분석은 조사중인 분야입니다. 이 프로토콜은 질량 분광법 기반 워크플로의 스캡을 해결합니다. 질량 분광법은 매우 민감하며 관심있는 특정 신경 펩티드를 표적으로 삼거나 샘플 내에서 다양한 신경 펩티드를 포획하고 검출 할 수 있습니다.
질량 분광법에 의한 뉴로펩타이드 발현의 정량화 및 국소화는 펩타이드 치료제의 개발과 다양한 질병에 대한 뉴로펩타이드 바이오마커의 발견으로 이어질 수 있다. 신경 펩티드 추출을 시작하기 위해 갑각류로부터 뇌 조직을 수집하고 포셉을 사용하여 즉시 하나의 조직을 20 마이크로리터의 산성화 메탄올이 들어있는 0.6 밀리리터 튜브에 넣는다. 150 마이크로리터의 산성화된 메탄올을 샘플에 첨가한다.
총 소닉 환자 시간을 24초로, 펄스 시간을 8초로 설정합니다. 초음파 균질 기에서 진폭을 50 %로 15 초까지 일시 중지하고 얼음 위에서 샘플을 균질화하십시오. 샘플을 섭씨 4도에서 20, 000 GS에서 20분 동안 원심분리한다.
피펫으로 상층액을 튜브로 옮기고 약 섭씨 35도의 진공 농축기에서 건조시킵니다. 탈염을 위해 추출된 조직 샘플을 0.1%포름산의 20 마이크로리터로 재구성한다. 용액을 소용돌이 치며 실온 수조에서 잠시 동안 초음파 처리하십시오.
pH가 네 개 미만인지 확인하기 위해 pH 스트립에 0.5 마이크로리터의 샘플을 적용하십시오. 섭씨 4도 및 20, 000 GS에서 30초 동안 원심분리한다. 환상 용액으로 습윤 평형 세척을 준비하십시오.
C18 수지로 10 마이크로리터 탈염 팁을 얻었다. 탈염 팁을 15 마이크로리터로 설정된 20 마이크로리터 피펫에 놓습니다. 젖은 용액으로 팁을 세 번, 동등한 협업 솔루션으로 세 번 흡인하십시오.
시료를 10회 흡인한 다음, 세척액으로 세 번 세척하여 각 세척액을 버리고 버린다. 아세토니트릴을 증가시키기 위해 각각의 환상 해결책에서 10 번 흡인하여 황홀하게하십시오. 암시된 뉴로펩티드를 진공 농축기에서 건조시킨다.
건조된 탈염된 뉴로펩티드를 0.1%포름산의 다섯 마이크로리터로 재구성한다. 용액을 소용돌이 치며 실온에서 일분 동안 초음파 처리하십시오. 2000 GS에서 간단히 원심분리. 신경 펩티드 및 갑각류 조직의 스포팅을 위해, 세 마이크로리터의 샘플 방울을 소수성 필름 상에 피펫팅한다.
DHB 매트릭스의 세 마이크로리터를 샘플 액적 상에 직접 피펫한다. 위아래로 피펫팅하여 솔루션을 혼합하십시오. 샘플 및 매트릭스 혼합물의 한 마이크로리터를 MALDI 스테인리스강 타겟판의 웰에 넣고 피펫 팁을 사용하여 각 혼합물을 샘플의 가장자리로 잘 퍼뜨린다.
일대일 구경 및 매트릭스 혼합물의 한 마이크로리터를 샘플 근처의 웰로 스팟하십시오. 건조된 샘플 스폿이 포함된 표적 플레이트를 MALDI 탠덤 비행 시간 장비에 삽입합니다. DHB 매트릭스가 레이저 파워를 95%로 설정하여 자동 최적 검출기 게인과 스마트 전체 샘플 캐리어 이동 모드를 선택합니다.
Z를 통해 200 ~ 3, 200 M의 범위에서 MS 스펙트럼을 획득하고 각 스팟에서 여러 스펙트럼을 함께 추가하여 신경 펩티드 신호 대 잡음비를 증가시킵니다. 냉동 컵 절반을 젤라틴으로 채우고 실온에서 응고되도록하십시오. 남은 액체 젤라틴을 섭씨 37도 수조에서 따뜻하게 유지하십시오.
동물로부터 원하는 신경 조직을 수집하고 포셉을 사용하여 조직을 즉시 탈이온수가 들어있는 0.6 밀리리터 튜브에 담그십시오. 조직을 고체 젤라틴 위에 놓고 나머지 냉동 컵을 액체 젤라틴으로 채 웁니다. 포셉을 사용하여 조직을 배치하십시오.
cryostat 컵을 평평한 표면에 놓고 드라이 아이스로 얼립니다. 단면화 준비를 위해 젤라틴 매립 샘플을 금형을 절단하여 냉동 주형으로부터 분리하십시오. 매립된 조직을 척에 탈이온수 한 밀리리터 방울을 피펫팅하고 즉시 매립된 조직을 액적 위로 밀어 넣음으로써 냉동 척 상에 장착한다.
일단 피펫을 동결시키면, 조직 주위에 더 많은 탈이온수를 제거하여 척에 더 고정시킨다. 조직을 한 세포의 대략적인 두께로 단면화하십시오. 엄지 손가락으로 슬라이드의 한쪽을 섹션 근처에 놓고 슬라이드의 다른 쪽에 손가락을 올려 놓아 각 섹션을 인듐 주석 산화물 코팅 유리 슬라이드에 장착하여 천천히 유리를 따뜻하게하고 섹션이 슬라이드에 달라 붙게합니다.
De Novo 펩타이드 만 내보내기. 평균 지역 신뢰도 점수가 75보다 크거나 같은 피크에서 CSV입니다. 특정 뉴로펩티드 패밀리에 속하는 뉴로펩티드를 나타내는 공지된 서열 모티프에 대해 펩티드 리스트를 검색한다.
관심있는 알려진 사전 프로 호르몬 아미노산 서열을 선택하고 TB blast N을 사용하여 데이터베이스에 대해 사전 프로 호르몬 서열을 검색하십시오. 표적 유기체를 선택하고 기대 역치 알고리즘 파라미터를 1000으로 변경하여 낮은 점수 정렬을 포함한다. 블래스트 프로그램을 실행한 다음, 상당한 정렬을 생성하는 질의와 피험자 서열 사이의 높은 상동성 스코어에 대한 결과를 확인한다.
뉴클레오티드 서열이 포함된 FASTA 파일을 저장합니다. Expasy 번역 도구를 사용하여 pre-pro 호르몬 뉴클레오티드 서열을 pre-pro 호르몬 펩티드 서열로 번역하십시오. callinectes의 경우 sapidus는 유전 암호에 대한 무척추 동물 미토콘드리아를 선택하고 도구를 실행합니다.
신호 P를 사용하여 펩티드 서열에서 신호 펩티드 서열 및 프로호르몬 절단 부위를 확인한다.이것은 최대 한계 0.02 달톤의 낮은 단편 질량 오차에서 100% 서열 커버리지로 확인된 뉴로펩티드의 단편화 스펙트럼이다. 여기에 100 % 서열 커버리지로 확인 된 신경 펩티드의 스펙트럼이 있지만 단편 이온의 수가 적기 때문에 확인의 신뢰도가 낮습니다. 이들은 단일 뉴로펩티드에 대한 추출된 이온 크로마토그램이며, 이는 두 개의 분리되고 연속적인 실행에서 확인되었다.
보존 시간이 약간 다르더라도 시간 이동이 1분 미만이기 때문에 레이블이 없는 정량화에 계속 사용할 수 있습니다. 이는 디메틸 표지된 뉴로펩티드를 함유하는 전체 주사 질량 스펙트럼의 예이며, 이는 경쇄 및 무거운 형태의 뉴로펩티드 사이의 4.025 달톤 질량 이동을 초래한다. De Novo 서열화된 펩티드의 단편 이온 질량 스펙트럼은 양호한 단편화 커버리지를 입증하며, 여기서 B 및 또는 Y 단편 이온은 0.02 달톤의 낮은 질량 오차를 갖는 각 아미노산에 대해 관찰되었다.
이는 갑각류 RYMI 뉴로펩타이드 패밀리에 속하는 내인성 펩티드가 관찰되었음을 나타낸다. 우물 조각의 모든 가장자리에 닿는 좋은 반점의 예가 왼쪽에 표시됩니다. 그리고 나쁜 반점의 예가 오른쪽에 표시됩니다.
캘리넥테스 사피두스 조직으로부터 뉴로펩티드의 MALDI MS 이미징 후, Z 값 이상의 다양한 M의 이온 분포 이미지가 상이한 뉴로펩티드에 상응하는 수득되었다. 특정 분석 유형에 대한 추출 용매 최적화가 중요합니다. 또한 완전한 균질화가 발생하는지 확인하고 필요에 따라 방법을 조정하십시오.
추출되지 않으면 다운스트림에서 아무 것도 감지되지 않습니다. 이 기술은 잠재적 바이오마커로서 추가로 조사될 수 있는 중요한 뉴로펩티드의 기초 목록을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 항체에 대한 필요 없이 표적화되지 않은 국소화 정보를 제공할 수 있다.
