A análise de peptídeos endógenos, que são menores que a maioria das proteínas, mas maiores do que muitos peptídeos digeridos é um campo sob análise. Este protocolo aborda a scap em fluxos de trabalho baseados em espectrometria de massa. A espectrometria de massa é altamente sensível e pode ser usada para atingir neuropeptídeos específicos de interesse ou pode capturar e detectar uma gama de neuropeptídeos dentro de uma amostra.
A quantitação e localização da expressão de neuropeptídeo por espectrometria de massa pode levar ao desenvolvimento de terapêutica de peptídeos e à descoberta de biomarcadores de neuropeptídeos para várias doenças. Para começar, a extração de neuropeptídeos coleta tecido cerebral do crustáceo e usando fórceps imediatamente coloque um tecido cada um em um tubo de 0,6 mililitro contendo 20 microliters de metanol acidificado. Adicione 150 microliters de metanol acidificado à amostra.
Defina o tempo total do paciente Sonic para 24 segundos, tempo de pulso para oito segundos. Pausar o tempo para 15 segundos uma amplitude de 50% em um homogeneizador ultrassônico e homogeneizar as amostras no gelo. Centrifugar a amostra a quatro graus Celsius a 20.000 GS por 20 minutos.
Com uma pipeta transferiu o supernasal para um tubo e secou-o em um concentrador de vácuo a aproximadamente 35 graus Celsius. Para desalar reconstituir a amostra de tecido extraído em 20 microlitres de ácido fórmico de 0,1%. Vórtice a solução e sonicate em um banho de água de temperatura ambiente por um minuto.
Aplique 0,5 microliters de amostra em uma tira de pH para confirmar que o pH é menor que quatro. Centrífuga a 4 graus Celsius e 20.000 GS por 30 segundos. Prepare a lavagem de equilíbrio de molhar em soluções de ilusão.
Obtenha uma ponta de desalar 10 microliter com resina C18. Coloque a ponta de desalado em uma pipeta de 20 microliteres que está definida para 15 microliters. Aspire a ponta três vezes com solução de molhar e três vezes com solução de colaboração equi.
Aspirar na amostra 10 vezes seguido de lavar três vezes na solução de lavagem descartando cada lavagem. Elute aspirando 10 vezes em cada uma das soluções de ilusão para aumentar a Acetonitrila. Seque os neuropeptídeos aludidos em um concentrador de vácuo.
Reconstitua os neuropeptídeos dessacados secos em cinco microlitres de ácido fórmico de 0,1%. Vórtice a solução e sonicate-lo em um banho de água de temperatura ambiente por um minuto. Centrífuga breve a 2000 GS. Para detectar neuropeptídeos e tecidos de crusta, pipeta uma gota de três microliter de amostra em um filme hidrofóbico.
Pipeta três microliters de matriz DHB diretamente na gotícula amostral. Misture as soluções com tubulação para cima e para baixo. Pipeta um microliter da mistura de amostra e matriz em um poço da placa de aço inoxidável MALDI e use a ponta pipeta para espalhar cada mistura para as bordas da amostra bem.
Localmente um microliter de calibre um para um e mistura de matriz em um poço perto da amostra. Insira a placa-alvo contendo manchas de amostra seca no instrumento de tempo de voo MALDI tandem. Com a matriz DHB definida a potência laser para 95%Selecione o ganho automático do detector ideal e o modo de movimento inteligente do portador da amostra completa.
Adquira o MS Spectra na faixa de 200 a 3.200 M sobre Z e adicione vários espectros de cada ponto juntos para aumentar o sinal de neuropeptídeo para a relação ruído. Encha meio copo criostat com gelatina e deixe-o solidificar à temperatura ambiente. Mantenha a gelatina líquida restante quente em um banho de água de 37 graus Celsius.
Colete tecido neuronal desejado do animal e use fórceps para mergulhar imediatamente o tecido em um tubo de 0,6 mililitro contendo água deionizada por um segundo. Coloque o tecido em cima da gelatina sólida e encha o resto do copo criostat com gelatina líquida. Use fórceps para posicionar o tecido.
Coloque o copo criostat em uma superfície plana e congele com gelo seco. Para a preparação da secção, separe a amostra embutida de gelatina do molde criostat, cortando o molde. Monte o tecido incorporado em um mandril criostat, canalizado uma gota de um mililitro de água desionizada no mandril e pressione imediatamente o tecido incorporado na gotícula.
Uma vez congelada, mais água deionizada ao redor do tecido para fixá-la ainda mais no mandril. Selado o tecido com uma espessura aproximada de uma célula. O polegar monta cada seção em um slide de vidro revestido de óxido de lata de índio colocando um lado do slide perto da seção e colocando um dedo do outro lado do slide para aquecer lentamente o vidro e permitir que a seção grude no slide.
Exportar de Novo apenas peptídeos. CSV de picos com pontuação média de confiança local maior ou igual a 75. Pesquise na lista de peptídeos por motivos de sequência conhecidos indicativos de neuropeptídeos pertencentes a famílias específicas de neuropeptídeos.
Escolha uma sequência de aminoácidos hormonais pré-pro conhecidos e use a explosão de TB N para pesquisar a sequência hormonal pré-pro de consulta contra um banco de dados. Selecione o organismo alvo e altere os parâmetros do algoritmo limiar até 1000 para incluir alinhamentos de pontuação baixa. Execute o programa de explosão e, em seguida, verifique os resultados para obter altos escores de escoologia entre consultas e sequências de assunto produzindo alinhamentos significativos.
Salve o arquivo FASTA contendo sequência de nucleotídeos. Traduza a sequência de nucleotídeos hormonais pré-pro em sequências de peptídeos hormonais pré-pro usando a ferramenta de tradução expasy. Para chamadas sapidus selecione mitocondrial invertebrado para código genético e execute a ferramenta.
Verifique se há sequência de peptídeos de sinal e locais de decote pro hormonal nas sequências de peptídeos usando sinal P.Este é um espectro de fragmentação de um neuropeptídeo identificado com cobertura de sequência de 100% em um erro de massa de fragmento baixo com um limite máximo de 0,02 Dalton. Aqui está um espectro de um neuropeptídeo também identificado com cobertura de 100%, mas com um baixo número de íons fragmentários, portanto a confiança da identificação é baixa. Estes são os cromatógrafos de íons extraídos para um único neuropeptídeo que foi identificado em duas corridas separadas e consecutivas.
Embora o tempo de retenção difere ligeiramente, isso ainda pode ser usado para quantificação sem rótulo, porque a mudança de tempo é inferior a um minuto. Este é um exemplo de um espectro de massa de varredura completa contendo um neuropeptídeo que foi rotulado dimetil resultando em uma mudança de massa dalton 4.025 entre as formas leves e pesadas do neuropeptídeo. O espectro de massa de íons fragmentos de um peptídeo sequenciado de De Novo demonstra boa cobertura de fragmentação, onde íon de fragmento B e ou Y foi observado para cada aminoácido com um erro de massa baixo de 0,02 Dalton.
Isso indica que foi observado um peptídeo endógeno pertencente à família de neuropeptídeos RYMI crustáceos. Exemplos de bons pontos que tocam todas as bordas da gravação do poço são mostrados à esquerda. E exemplos de pontos ruins são mostrados à direita.
Após a imagem MALDI MS de neuropeptídeos de tecidos de callinectes sapidus, foram obtidas imagens de distribuição de íons de vários valores M sobre Z correspondentes a diferentes neuropeptídeos. A otimização do solvente de extração para um determinado tipo analy é crucial. Também garantir a homogeneização completa e ajustar o método conforme necessário.
Nada será detectado rio abaixo se não for extraído. Esta técnica pode fornecer uma lista fundamental de neuropeptídeos importantes que podem ser ainda mais investigados como potenciais biomarcadores, bem como fornecer informações de localização não-marcadas sem a necessidade de anticorpos.
