Die Analyse von endogenen Peptiden, die kleiner als die meisten Proteine, aber größer als viele verdaute Peptide sind, ist ein wenig untersuchtes Gebiet. Dieses Protokoll adressiert den Scap in massenspektrometriebasierten Workflows. Die Massenspektrometrie ist hochempfindlich und kann verwendet werden, um bestimmte Neuropeptide von Interesse anzusprechen oder eine Reihe von Neuropeptiden innerhalb einer Probe zu erfassen und nachzuweisen.
Die Quantifizierung und Lokalisierung der Neuropeptidexpression durch Massenspektrometrie kann zur Entwicklung von Peptidtherapeutika und zur Entdeckung von Neuropeptid-Biomarkern für verschiedene Krankheiten führen. Um mit der Neuropeptidextraktion zu beginnen, sammeln Sie Hirngewebe aus dem Krustentier und legen Sie mit einer Pinzette sofort jeweils ein Gewebe in ein 0,6-Milliliter-Röhrchen, das 20 Mikroliter angesäuertes Methanol enthält. 150 Mikroliter angesäuertes Methanol in die Probe geben.
Stellen Sie die Gesamtpatientenzeit von Sonic auf 24 Sekunden und die Pulszeit auf acht Sekunden ein. Pausieren Sie die Zeit auf 15 Sekunden und eine Amplitude auf 50% auf einem Ultraschallhomogenisator und homogenisieren Sie die Proben auf Eis. Zentrifugieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius bei 20.000 GS für 20 Minuten.
Mit einer Pipette wurde der Überstand auf ein Rohr übertragen und in einem Vakuumkonzentrator bei etwa 35 Grad Celsius getrocknet. Zum Entsalzen wird die extrahierte Gewebeprobe in 20 Mikrolitern 0,1%Ameisensäure rekonstituiert. Wirbeln Sie die Lösung ein und beschallen Sie sie eine Minute lang in einem Wasserbad bei Raumtemperatur.
Tragen Sie 0,5 Mikroliter Probe auf einen pH-Streifen auf, um zu bestätigen, dass der pH-Wert weniger als vier beträgt. Zentrifen Sie bei vier Grad Celsius und 20.000 GS für 30 Sekunden. Bereiten Sie die Benetzungsgleichgewichtswäsche in Illusionslösungen vor.
Erhalten Sie eine 10 Mikroliter Entsalzungsspitze mit C18-Harz. Legen Sie die Entsalzungsspitze auf eine 20-Mikroliter-Pipette, die auf 15 Mikroliter eingestellt ist. Saugen Sie die Spitze dreimal mit der Benetzungslösung und dreimal mit der Equi-Kollaborationslösung ab.
10 Mal in der Probe abspritzen, gefolgt von dreimaligem Waschen in Waschlösung, wobei jede Wäsche verworfen wird. Eluten, indem sie 10 Mal in jeder der Illusionslösungen in der Reihenfolge der Erhöhung des Acetonitrils aspirieren. Trocknen Sie die angedeuteten Neuropeptide in einem Vakuumkonzentrator.
Rekonstituieren Sie die getrockneten entsalzten Neuropeptide in fünf Mikrolitern 0,1% Ameisensäure. Wirbeln Sie die Lösung auf und beschallen Sie sie in einem Wasserbad bei Raumtemperatur für eine Minute. Kurz zentrifugieren bei 2000 GS. Zur Schmierblutung von Neuropeptiden und Krustengewebe pipettieren Sie einen drei Mikroliter großen Probentropfen auf einen hydrophoben Film.
Drei Mikroliter DHB-Matrix direkt auf den Probentropfen pipettieren. Mischen Sie die Lösungen, indem Sie sie nach oben und unten pipettieren. Pippettiert einen Mikroliter der Proben- und Matrixmischung in eine Vertiefung der MALDI-Edelstahl-Zielplatte und verwendet die Pipettenspitze, um jede Mischung an den Rändern der Probenvertiefung zu verteilen.
Suchen Sie einen Mikroliter Eins-zu-Eins-Kaliber und Matrixmischung in einem Brunnen in der Nähe der Probe. Legen Sie die Zielplatte mit getrockneten Probenflecken in das MALDI-Tandem-Time-of-Flight-Instrument ein. Mit der DHB-Matrix wird die Laserleistung auf 95% eingestellt. Wählen Sie die automatische optimale Detektorverstärkung und den intelligenten vollständigen Probenträgerbewegungsmodus.
Erfassen Sie MS-Spektren im Bereich von 200 bis 3.200 M über Z und fügen Sie mehrere Spektren von jedem Punkt zusammen hinzu, um das Verhältnis von Neuropeptidsignal zu Rauschen zu erhöhen. Füllen Sie einen halben Kryostatenbecher mit Gelatine und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur erstarren. Halten Sie übrig gebliebene flüssige Gelatine in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.
Sammeln Sie das gewünschte neuronale Gewebe vom Tier und tauchen Sie das Gewebe mit einer Pinzette sofort für eine Sekunde in ein 0,6-Milliliter-Röhrchen mit deionisiertem Wasser. Legen Sie das Gewebe auf die feste Gelatine und füllen Sie den Rest des Kryostatbechers mit flüssiger Gelatine. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe zu positionieren.
Den Kryostatenbecher auf eine ebene Fläche stellen und mit Trockeneis einfrieren. Für die Schnittvorbereitung trennen Sie die eingebettete Gelatineprobe von der Kryostatform, indem Sie die Form wegschneiden. Montieren Sie das eingebettete Gewebe auf einem Kryostat-Futter, indem Sie ein Milliliter-Tröpfchen deionisiertes Wasser auf das Futter pipettieren und das eingebettete Gewebe sofort auf das Tröpfchen drücken.
Einmal gefrorene Pipette, mehr deionisiertes Wasser um das Gewebe, um es weiter am Spannfutter zu befestigen. Schneiden Sie das Gewebe mit einer ungefähren Dicke einer Zelle ab. Befestigen Sie jeden Abschnitt mit dem Daumen auf einem mit Indiumoxidoxid beschichteten Glasobjektträger, indem Sie eine Seite des Objektträgers in der Nähe des Abschnitts platzieren und einen Finger auf die andere Seite des Objektträgers legen, um das Glas langsam zu erwärmen und den Abschnitt am Objektträger haften zu lassen.
Exportieren Sie nur De Novo Peptide. CSV von Spitzenwerten mit einem durchschnittlichen lokalen Konfidenzwert von mehr als oder gleich 75. Durchsuchen Sie die Peptidliste nach bekannten Sequenzmotiven, die auf Neuropeptide hinweisen, die zu bestimmten Neuropeptidfamilien gehören.
Wählen Sie eine bekannte Pre-Pro-Hormon-Aminosäuresequenz von Interesse und verwenden Sie TB blast N, um die Pre-Pro-Hormonsequenz anhand einer Datenbank abzufragen. Wählen Sie den Zielorganismus aus und ändern Sie die Parameter des Erwartungsschwellenwertalgorithmus in 1000, um Low-Score-Alignments einzubeziehen. Führen Sie das Blast-Programm aus und überprüfen Sie dann die Ergebnisse auf hohe Homologiewerte zwischen Abfrage- und Subjektsequenzen, die zu signifikanten Ausrichtungen führen.
Speichern Sie die FASTA-Datei mit der Nukleotidsequenz. Übersetzen Sie die Pre-Pro-Hormon-Nukleotidsequenz mit dem Expasy Translate-Tool in Pre-Pro-Hormonpeptidsequenzen. Für Callinectes sapidus wählen Sie wirbellose Mitochondrien für genetischen Code und führen Sie das Werkzeug aus.
Überprüfen Sie die Signalpeptidsequenz und die Prohormonspaltungsstellen in den Peptidsequenzen mit dem Signal P.Dies ist ein Fragmentierungsspektrum eines Neuropeptids, das mit einer 100%igen Sequenzabdeckung in einem niedrigen Fragmentmassenfehler mit einer maximalen Grenze von 0,02 Dalton identifiziert wurde. Hier ist ein Spektrum eines Neuropeptids, das ebenfalls mit einer 100%igen Sequenzabdeckung identifiziert wurde, aber mit einer geringen Anzahl von Fragmentionen, daher ist das Vertrauen der Identifizierung gering. Dies sind die extrahierten Ionenchromatogramme für ein einzelnes Neuropeptid, das in zwei separaten und aufeinanderfolgenden Durchläufen identifiziert wurde.
Auch wenn sich die Verweilzeit leicht unterscheidet, kann diese dennoch für die labelfreie Quantifizierung verwendet werden, da die Zeitverschiebung weniger als eine Minute beträgt. Dies ist ein Beispiel für ein vollständiges Scan-Massenspektrum, das ein Neuropeptid enthält, das Dimethyl markiert wurde, was zu einer 4,025 Dalton-Massenverschiebung zwischen den leichten und schweren Formen des Neuropeptids führt. Das Fragmentionen-Massenspektrum eines De Novo-sequenzierten Peptids zeigt eine gute Fragmentierungsabdeckung, wobei für jede Aminosäure ein B- und/oder Y-Fragmention mit einem geringen Massenfehler von 0,02 Dalton beobachtet wurde.
Dies deutet darauf hin, dass ein endogenes Peptid der Krebstier-RYMI-Neuropeptidfamilie beobachtet wurde. Beispiele für gute Stellen, die alle Kanten der Brunnengravur berühren, sind auf der linken Seite gezeigt. Und Beispiele für schlechte Flecken sind auf der rechten Seite dargestellt.
Nach der MALDI-MS-Bildgebung von Neuropeptiden aus Callinectes sapidus-Geweben wurden Ionenverteilungsbilder verschiedener M über Z-Werte erhalten, die verschiedenen Neuropeptiden entsprechen. Die Optimierung des Extraktionslösungsmittels für einen bestimmten Analysetyp ist von entscheidender Bedeutung. Stellen Sie außerdem sicher, dass eine vollständige Homogenisierung stattfindet, und passen Sie die Methode nach Bedarf an.
Nichts wird nachgelagert erkannt, wenn es nicht extrahiert wird. Diese Technik kann eine grundlegende Liste wichtiger Neuropeptide liefern, die als potenzielle Biomarker weiter untersucht werden können, sowie ungezielte Lokalisierungsinformationen liefern, ohne dass Antikörper benötigt werden.
