פרוטוקול זה מאפשר לפתור את השלד התקופתי של הממברנה במקטע הראשוני של האקסון של נוירונים מתורבתים. על ידי בחינת הלוקליזציה של חלבונים תובנה ניתן להשיג לתוך הפונקציה בשלד תקופתי הממברנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא חוסנה וקלות השימוש שלה.
מיקרוסקופיה מובנית של תאורה מסוגלת לפתור את השלד התקופתי של הממברנה והכנת המדגם קלה ופשוטה. כל מי שיש לו ניסיון קודם במיקרוסקופיה פלואורסצנטית יכול ליישם בקלות טכניקה זו. פרוטוקול זה נועד למקסם את יחס האות לרעש במהלך הכנת הדגימה והדמיה.
כדי להתחיל, לתקן את הנוירונים באמצעות 4% Paraformaldehyde במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את פתק הכיסוי פעם אחת ב 0.2% BSA בתמיסת חיץ פוספט ודגור במשך 10 דקות בתמיסה של 1% של טריטון X ב PBS בטמפרטורת החדר. לשטוף את להחליק הכיסוי עם BSA בתמיסת חיץ פוספט, לדלל את נוגדני G אנטי אנקירין באמצעות BSA בתמיסת חיץ פוספט ביחס של אחד עד 200.
הוסיפו את תמיסת הנוגדנים לתעודת הכיסוי ודגרו בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים פעם אחת בתמיסת מאגר פוספט BSA פעם אחת ב 0.1%Triton X בתמיסת מאגר פוספט ופעם אחת בפתרון מאגר פוספט. לדלל פלואורו 4 מתויג, להוסיף עוד נוגדנים משניים בתמיסת מאגר פוספט BSA ולהוסיף לתעודת הכיסוי.
לשטוף את התאים פעם אחת בתמיסת מאגר פוספט BSA פעם אחת ב 0.1%Triton X בתמיסת מאגר פוספט, ולאחר מכן פעם אחת בתמיסת מאגר פוספט. הכן פתרון מיקרומולרי אחד של מתויג Ferodin בתמיסת חיץ פוספט ולהוסיף אותו לתאים. לשטוף את התאים פעם אחת בפתרון חיץ פוספט אלבומין אלבומין סרום בקר פעם אחת ב 0.1%Triton X בתמיסת חיץ פוספט, ולאחר מכן פעם אחת בתמיסת חיץ פוספט.
להרכבה על החלקת הכיסוי על מגלשת זכוכית, החל טיפה של מדיה הרכבה על שקופית, לטבול את החלקת הכיסוי במים deionized, והקש אותו עם מגבת נייר רכה כדי להסיר מים עודפים. מניחים את פתק הכיסוי על מגלשת הזכוכית ודגור בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות. במידת האפשר, יש להתייעץ עם אנשי הצוות ממתקן המיקרוסקופיה לפני ההדמיה ולהשתמש במחשבון שמן טבילה כדי לבחור את שמן הטבילה המתאים לדגימה.
לאחר שהדגימות מוכנות, ודאו שהחלקות הכיסוי נקיות ונקיות מכל שאריות על ידי ניקוין עם קצה כותנה טבול במים או אתנול. מקם את הדגימה במיקרוסקופ 3D-SIM ומצא את התא כדי ללכוד את התמונה. התאם את העוצמה של קווי הלייזר הרלוונטיים.
וזמני החשיפה כדי למקסם את יחס האות לרעש מבלי להלבין באופן משמעותי את המדגם. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של המדגם בממד Z והמשיך לרכוש מחסנית. הפעל את אלגוריתם השחזור על הערימה כדי לקבל שחזור סופר נפתר.
בדוק את השחזורים עבור חפצים ידועים ואם יש צורך, להתאים את הפרמטרים כדי לתקן אותם. השווה את שחזור ה- SIM לתמונת שדה רחבה כדי לבחון שיפורים ברזולוציה. בעת ביצוע מיקרוסקופיה מובנית של תאורה צבעונית, השתמש באלגוריתם היישור כדי ליישר את הערוצים השונים כראוי, ברגע ששחזור משביע רצון מוכן.
טבעות אקטין בשלד המחזורי של הממברנה יש מראה תקופתי ייחודי. צור תמונת הקרנה בעוצמה מרבית בתוכנת ניתוח תמונה באמצעות כל מישורי המוקד שבהם טבעות האקטין גלויות. בתמונת ההקרנה בעוצמה המרבית, צייר קו מאונך על-פני טבעות סמוכות גלויות לעין ורשום את עוצמת הפלואורסצנטיות יחד עם פונקציית פרופיל התוויית הקו של התוכנה.
כדי לחשב את המרחק הבין-שיא הממוצע, שים לב למקסימה המקומית בפרופיל הקו ומדוד את המרחק בין פסגות עוצמה פלואורסצנטיות סמוכות בודדות. כדי להעריך את colocalization של חלבונים שונים עם טבעות actin בשלד תקופתי הממברנה, להפעיל הליך ניתוח colocalization על שחזורי SIM של אקטין ואת חלבון המועמד. צייר באופן ידני בחירה כדי להגדיר את פלח השוק ההתחלתי של האקסון כאזור עניין, עבור תוסף colocalization קל בפלטפורמת התוכנה, ולהפעיל את הניתוח כדי לחשב את מקדם המתאם של פירסון עבור colocalization.
במהלך ניתוח תמונת SIM, השחזורים של ערימות תמונה, הראו תקופתיות ברורה של טבעות אקטין. נוגדן אנטי אנקירין G שימש כדי לדמיין ankyrin G.The colocalization של אנקרין G וטבעות actin נבדק במגזר הראשוני אקסון באמצעות הליך ניתוח colocalization כדי לחשב את מקדם המתאם של פירסון. מקדם המתאם של פירסון לקולוקאליזציה של אנקרין G וטבעות אקטין פלואורסצנטיות היה 0.36 פלוס או מינוס 0.03.
זה חיוני כדי להשתמש בשמן הטבילה הנכון ולהתאים את כוח הלייזר ואת זמן החשיפה כדי להפוך את קווי הרשת גלויים. ברגע שנקבע כי חלבון הוא חלק מהשלד התקופתי של הממברנה, ניתן לחקור את תפקידו ולהקים אותו בשמירה על השלד התקופתי של הממברנה. לדוגמה, ניתן לנתח את ההשפעות של הפלת החלבון על טבעות אקטין.
הפיתוח של טכניקות מיקרוסקופיות ברזולוציית-על הוא הסיבה שאנו יודעים שהמקטע הראשוני של האקסון מכיל שלד תקופתי של ממברנה המורכב מטבעות אקטין, ספקטרום ואנקירין. SIM אפשר לחוקרים לדמיין בקלות רכיבי שלד תקופתיים של הממברנה ולהסתכל על טבעות אקטין בתאים חיים.
