Este protocolo permite resolver o esqueleto periódico da membrana no segmento inicial de neurônios cultivados. Examinando a localização de proteínas, a percepção pode ser adquirida na função no esqueleto periódico da membrana. A principal vantagem dessa técnica é sua robustez e facilidade de uso.
A microscopia de iluminação estruturada é capaz de resolver o esqueleto periódico da membrana e a preparação da amostra é fácil e simples. Qualquer pessoa com experiência prévia em microscopia de fluorescência pode facilmente implementar essa técnica. Este protocolo foi projetado para maximizar a relação sinal/ruído durante a preparação da amostra e a imagem.
Para começar, fixar os neurônios usando 4% paraformaldeído por 12 minutos em temperatura ambiente. Lave o deslizamento da tampa uma vez em 0,2% BSA em solução tampão fosfato e incuba por 10 minutos em uma solução de 1% de Triton X em PBS à temperatura ambiente. Lave o deslizamento de tampa com BSA na solução tampão de fosfato, diluir os anticorpos anti ankyrin G usando BSA em uma solução tampão de fosfato na proporção de um a 200.
Adicione a solução de anticorpos ao deslizamento da tampa e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Lave as células uma vez na solução tampão de fosfato BSA uma vez em 0,1% Triton X em solução tampão fosfato e uma vez na solução tampão fosfato. Diluir Fluoro 4 marcado, adicionar mais anticorpos secundários na solução tampão de fosfato BSA e adicionar ao deslizamento de tampa.
Lave as células uma vez na solução tampão de fosfato BSA uma vez em 0,1% Triton X em solução tampão fosfato, depois uma vez na solução tampão fosfato. Prepare uma solução micromolar de Ferodin marcado na solução tampão de fosfato e adicione-a às células. Lave as células uma vez na solução tampão fosfato de gógo do Soro Bovino uma vez em 0,1% Triton X em solução tampão fosfato, depois uma vez na solução tampão fosfato.
Para montar o deslizamento da tampa em um slide de vidro, aplique uma gota de mídia de montagem em um slide, mergulhe o deslizamento da tampa em água desionizada e bata-a com uma toalha de papel macia para remover o excesso de água. Coloque o deslizamento de tampa no escorregador de vidro e incubar em temperatura ambiente por 24 horas. Se possível, consulte o pessoal da instalação de microscopia antes da imagem e use uma calculadora de óleo de imersão para selecionar o óleo de imersão adequado para a amostra.
Uma vez que as amostras estejam prontas, certifique-se de que os deslizamentos de cobertura estejam limpos e limpos de qualquer resíduo, limpando-os com uma ponta de algodão mergulhada em água ou etanol. Coloque a amostra em um microscópio 3D-SIM e encontre a célula para capturar a imagem. Ajuste o poder das linhas laser relevantes.
E os tempos de exposição para maximizar a relação sinal/ruído sem branquear significativamente a amostra. Defina os limites superiores e inferiores da amostra na dimensão Z e prossiga para adquirir uma pilha. Execute o algoritmo de reconstrução na pilha para obter uma reconstrução super resolvida.
Verifique as reconstruções se há artefatos conhecidos e, se necessário, ajuste os parâmetros para corrigi-los. Compare a reconstrução do SIM com uma imagem de campo ampla para observar melhorias na resolução. Ao realizar microscopia de iluminação estruturada multicolorida, use o algoritmo de alinhamento para alinhar corretamente os diferentes canais, uma vez que uma reconstrução satisfatória esteja pronta.
Anéis de actina no esqueleto periódico da membrana têm uma aparência periódica distinta. Crie uma imagem de projeção de intensidade máxima no software de análise de imagens usando todos os planos focais onde os anéis de actina são visíveis. Na imagem de projeção de intensidade máxima, desenhe uma linha perpendicular através de anéis adjacentes visíveis e registe a intensidade da fluorescência, juntamente com a função de perfil de enredo de linha do software.
Para calcular a distância média inter de pico, observe a máxima local no perfil da linha e meça a distância entre picos individuais de intensidade fluorescente adjacente. Para avaliar a colocalização de diferentes proteínas com anéis de actina no esqueleto periódico da membrana, execute um procedimento de análise de colocalização sobre as reconstruções sim de actina e a proteína candidata. Desenhe manualmente uma seleção para definir o segmento inicial do axônio como uma região de interesse, para o plugin de colocação fácil na plataforma de software, e execute a análise para calcular o coeficiente de correlação do Pearson para colocalização.
Durante a análise de imagens SIM, as reconstruções das pilhas de imagens mostraram clara periodicidade dos anéis actin. Um anticorpo anti ankyrin G foi usado para visualizar ankyrin G.A colocalização dos anéis ankyrin G e actin foi testada no segmento inicial do axônio usando um procedimento de análise de colocalização para calcular o coeficiente de correlação de Pearson. O coeficiente de correlação do Pearson para colocalização de anquilo G e anéis de actina fluorescência foi de 0,36 mais ou menos 0,03.
É essencial usar o óleo de imersão certo e ajustar a potência do laser e o tempo de exposição para tornar as linhas de grade visíveis. Uma vez determinado que a proteína faz parte do esqueleto periódico da membrana, sua função pode ser investigada e estabelecida na manutenção do esqueleto periódico da membrana. Por exemplo, os efeitos de derrubar a proteína em anéis de actina podem ser analisados.
O desenvolvimento de técnicas de microscopia de super resolução é a razão pela qual sabemos que o segmento inicial do axônio contém esqueleto periódico de membrana composto por anéis de actina, espectro e anquilírio. O SIM permitiu aos pesquisadores visualizar facilmente componentes periód periódicos de esqueletos da membrana e olhar para anéis de actina em células vivas.
