Этот протокол позволяет разрешить мембранный периодический скелет в исходном сегменте аксона культивируемых нейронов. Изучая локализацию белков, можно получить представление о функции в мембранном периодическом скелете. Основным преимуществом данной техники является ее прочность и простота использования.
Структурированная микроскопия освещения способна разрешать мембранный периодический скелет, а подготовка образца проста и понятна. Любой, у кого есть предыдущий опыт в флуоресцентной микроскопии, может легко реализовать этот метод. Этот протокол предназначен для максимизации отношения сигнал/шум во время подготовки образца и визуализации.
Для начала зафиксируйте нейроны с помощью 4% параформальдегида в течение 12 минут при комнатной температуре. Промыть крышку однократно в 0,2% BSA в фосфатном буферном растворе и инкубировать в течение 10 минут в 1%-ном растворе Тритона X в PBS при комнатной температуре. Промыть крышку с помощью BSA в фосфатном буферном растворе, разбавить анти-анкириновые G антитела с помощью BSA в фосфатном буферном растворе в соотношении один к 200.
Добавьте раствор антител к крышке и высиживайте в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Промыть клетки один раз в буферном растворе фосфата BSA один раз в 0,1% Тритон X в фосфатном буферном растворе и один раз в фосфатном буферном растворе. Разбавьте Fluoro 4 с меткой, добавьте больше вторичных антител в буферный раствор фосфата BSA и добавьте в крышку.
Промыть клетки один раз в фосфатном буферном растворе BSA один раз в 0,1% Тритон X в фосфатном буферном растворе, затем один раз в фосфатном буферном растворе. Готовят один микромолярный раствор меченого феродина в фосфатном буферном растворе и добавляют его в клетки. Промыть клетки один раз в буферном растворе фосфата альбумина бычьей сыворотки один раз в 0,1% Тритон X в фосфатном буферном растворе, затем один раз в фосфатном буферном растворе.
Для крепления крышки на стеклянной горке нанесите каплю монтажного носителя на слайд, окуните крышку в деионизированную воду и постучите по ней мягким бумажным полотенцем, чтобы удалить лишнюю воду. Поместите крышку на стеклянную горку и высиживайте при комнатной температуре в течение 24 часов. Если возможно, проконсультируйтесь с персоналом из центра микроскопии перед визуализацией и используйте калькулятор погружного масла, чтобы выбрать иммерсионное масло, подходящее для образца.
Как только образцы будут готовы, убедитесь, что крышки прозрачны и очищены от любых остатков, очистив их хлопковым наконечником, смоченным в воде или этаноле. Поместите образец в микроскоп 3D-SIM и найдите клетку для захвата изображения. Отрегулируйте мощность соответствующих лазерных линий.
А время экспозиции позволяет максимизировать соотношение сигнал/шум без значительного обесцвечивания образца. Установите верхний и нижний пределы образца в измерении Z и приступайте к получению стека. Запустите алгоритм реконструкции в стеке, чтобы получить реконструкцию с суперразрешением.
Проверьте реконструкции на наличие известных артефактов и при необходимости отрегулируйте параметры для их исправления. Сравните реконструкцию SIM-карты с широкоугольным изображением, чтобы увидеть улучшения в разрешении. При выполнении многоцветной структурированной микроскопии освещения используйте алгоритм выравнивания для правильного выравнивания различных каналов, как только будет готова удовлетворительная реконструкция.
Актиновые кольца в мембранном периодическом скелете имеют характерный периодический вид. Создайте проекционное изображение максимальной интенсивности в программном обеспечении для анализа изображений, используя все фокальные плоскости, где видны актиновые кольца. На проекционном изображении максимальной интенсивности нарисуйте перпендикулярную линию через видимые соседние кольца и запишите интенсивность флуоресценции вместе с функцией профиля линейного графика программного обеспечения.
Чтобы рассчитать среднее межпиковое расстояние, обратите внимание на локальные максимумы в профиле линии и измерьте расстояние между отдельными соседними пиками интенсивности флуоресцентной жидкости. Чтобы оценить колокализацию различных белков с актиновыми кольцами в мембранном периодическом скелете, запустите процедуру анализа колокализации на SIM-реконструкциях актина и белка-кандидата. Вручную нарисуйте выбор, чтобы определить начальный сегмент аксона как область интереса, для легкого плагина колокализации в программной платформе и запустите анализ для расчета коэффициента корреляции Пирсона для колокализации.
Во время анализа SIM-изображений, реконструкций стеков изображений, была показана четкая периодичность актиновых колец. Анти-анкириновое антитело G использовалось для визуализации анкирина G.Колокализацию анкириновых G и актиновых колец тестировали в исходном сегменте аксона с использованием процедуры анализа колокализации для расчета коэффициента корреляции Пирсона. Коэффициент корреляции Пирсона для колокализации флуоресценции анкириновых G и актиновых колец составил 0,36 плюс-минус 0,03.
Важно использовать правильное масло погружения и регулировать мощность лазера и время экспозиции, чтобы сделать линии сетки видимыми. Как только будет определено, что белок является частью мембранного периодического скелета, его функция может быть исследована и установлена в поддержании мембранного периодического скелета. Например, можно проанализировать влияние сбивания белка на актиновые кольца.
Развитие методов микроскопии со сверхвысоким разрешением является причиной, по которой мы знаем, что начальный сегмент аксона содержит мембранный периодический скелет, состоящий из актиновых колец, спектра и анкирина. SIM позволил исследователям легко визуализировать мембранные периодические компоненты скелета и посмотреть на актиновые кольца в живых клетках.
