このプロトコルは、培養ニューロンの軸索初期セグメントにおける膜周期的骨格を解くことを可能にする。タンパク質の局在を調べることにより、膜周期骨格における機能についての洞察を得ることができる。この技術の主な利点は、その堅牢性と使いやすさです。
構造化照明顕微鏡は、膜周期骨格および試料調製を解決可能であり、容易かつ容易である。蛍光顕微鏡の以前の経験を持つ人なら誰でも、この技術を簡単に実装できます。このプロトコルは、サンプル調製およびイメージング中に信号対雑音比を最大化するように設計されています。
開始するには、室温で12分間、4%パラホルムアルデヒドを使用してニューロンを固定します。カバースリップをリン酸緩衝液中の0.2%BSA中で1回洗浄し、室温でPBS中のTriton Xの1%溶液中で10分間インキュベートする。カバースリップをリン酸緩衝液中のBSAで洗浄し、BSAを用いて抗アンキリンG抗体をリン酸緩衝液中で1対200の割合で希釈する。
抗体溶液をカバースリップに加え、摂氏4度で一晩インキュベートする。細胞をBSAリン酸緩衝液中で1回、リン酸緩衝液中の0.1%Triton X中で1回、リン酸緩衝液中で1回洗浄する。タグを付けたフルオロ4を希釈し、BSAリン酸緩衝液にさらに二次抗体を加え、カバースリップに加える。
細胞をBSAリン酸緩衝液中で1回、リン酸緩衝液中の0.1%Triton X中で1回、次いでリン酸緩衝液中で1回洗浄する。リン酸緩衝液中のタグ付きフェロジンの1マイクロモル溶液を調製し、それを細胞に加える。ウシ血清アルブミンリン酸緩衝液中で細胞を1回洗浄し、リン酸緩衝液中の0.1%Triton X中で1回、次いでリン酸緩衝液中で1回洗浄する。
スライドガラスにカバースリップを取り付ける場合は、スライドに装着用紙を一滴塗り、脱イオン水に浸し、柔らかいペーパータオルで叩いて余分な水分を除去します。カバースリップをスライドガラスの上に置き、室温で24時間インキュベートする。可能であれば、イメージング前に顕微鏡施設の担当者に相談し、浸漬油計算機を使用してサンプルに適した浸漬油を選択してください。
サンプルの準備ができたら、カバースリップを清潔にし、水またはエタノールに浸した綿の先端で洗浄して、残留物がないことを確認します。サンプルを3D-SIM顕微鏡に置き、画像をキャプチャする細胞を見つけます。関連するレーザーラインのパワーを調整します。
そして露光時間は、サンプルを著しく漂白することなく信号対雑音比を最大化する。サンプルの上限と下限をZ次元に設定し、スタックの取得に進みます。スタック上で再構成アルゴリズムを実行して、超解決された再構成を取得します。
再構成で既知のアーティファクトを確認し、必要に応じてパラメータを調整して修正します。SIM再構成を広視野画像と比較して、解像度の向上を観察します。多色構造化照明顕微鏡を実行する場合は、満足のいく再構成の準備ができたら、アライメントアルゴリズムを使用して異なるチャンネルを正しく整列させます。
膜周期骨格中のアクチン環は、独特の周期的外観を有する。アクチンリングが見えるすべての焦点面を使用して、画像解析ソフトウェアで最大強度投影画像を作成します。最大強度投影画像に、目に見える隣接するリングに垂直な線を描き、ソフトウェアのラインプロットプロファイル機能とともに蛍光強度を記録します。
平均ピーク間距離を計算するには、ラインプロファイルの極大値をメモし、隣接する個々の蛍光強度ピーク間の距離を測定します。膜周期骨格にアクチン環を有する異なるタンパク質の共局在を評価するために、アクチンおよび候補タンパク質のSIM再構成について共局在解析手順を実行する。ソフトウェアプラットフォームの簡単な共局在化プラグインのために、軸索初期セグメントを関心領域として定義する選択を手動で描画し、分析を実行して共局在化のためのピアソンの相関係数を計算します。
SIM画像解析の間、画像スタックの再構成は、アクチン環の明確な周期性を示した。抗アンキリンG抗体を用いてアンキリンGを可視化し、ピアソンの相関係数を計算するために、共局在解析手順を用いて軸索初期セグメントにおいてアンキリンGとアクチン環の共局在を試験した。アンキリンGおよびアクチン環蛍光の共局在に対するピアソンの相関係数は0.36プラスマイナス0.03であった。
適切な浸漬オイルを使用し、レーザー出力と露光時間を調整してグリッド線を見えるようにすることが不可欠です。タンパク質が膜周期骨格の一部であると判断されると、膜周期骨格を維持する上でその機能を調査し、確立することができます。例えば、アクチン環に対するタンパク質をノックダウンすることの影響を分析することができる。
超解像顕微鏡技術の開発は、軸索初期セグメントがアクチン環、スペクトルおよびアンキリンからなる膜周期骨格を含むことを知っている理由である。SIMにより、研究者は膜周期骨格成分を簡単に視覚化し、生細胞内のアクチン環を見ることができます。
