Questo protocollo consente di risolvere lo scheletro periodico della membrana nel segmento iniziale dell'assone dei neuroni in coltura. Esaminando la localizzazione delle proteine, è possibile ottenere informazioni sulla funzione nello scheletro periodico della membrana. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua robustezza e facilità d'uso.
La microscopia ad illuminazione strutturata è in grado di risolvere lo scheletro periodico della membrana e la preparazione del campione è facile e diretta. Chiunque abbia precedenti esperienze nella microscopia a fluorescenza può facilmente implementare questa tecnica. Questo protocollo è progettato per massimizzare il rapporto segnale/rumore durante la preparazione del campione e l'imaging.
Per iniziare, fissare i neuroni usando il 4% di paraformaldeide per 12 minuti a temperatura ambiente. Lavare il coperchio scivolare una volta nello 0,2% di BSA in soluzione tampone fosfato e incubare per 10 minuti in una soluzione all'1% di Triton X in PBS a temperatura ambiente. Lavare il coperchio con BSA in soluzione tampone fosfato, diluire gli anticorpi anti anchirina G usando BSA in una soluzione tampone fosfato con rapporto da uno a 200.
Aggiungere una soluzione anticorpale al coperchio e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule una volta in soluzione tampone fosfato BSA una volta nello 0,1% di Triton X in soluzione tampone fosfato e una volta in soluzione tampone fosfato. Diluire Fluoro 4 marcato, aggiungere più anticorpi secondari nella soluzione tampone fosfato BSA e aggiungere al coperchio slip.
Lavare le cellule una volta in soluzione tampone fosfato BSA una volta in 0,1% Triton X in soluzione tampone fosfato, quindi una volta in soluzione tampone fosfato. Preparare una soluzione micromolare di Ferodin marcata in soluzione tampone fosfato e aggiungerla alle cellule. Lavare le cellule una volta in soluzione tampone di albumina fosfato sierica bovina una volta nello 0,1% di Triton X in soluzione tampone fosfato, quindi una volta in soluzione tampone fosfato.
Per montare il coperchio scivolare su un vetrino, applicare una goccia di supporto di montaggio su una diapositiva, immergere il coperchio in acqua deionizzata e picchiettarlo con un tovagliolo di carta morbida per rimuovere l'acqua in eccesso. Posizionare il coperchio scivolare sul vetrino e incubare a temperatura ambiente per 24 ore. Se possibile, consultare il personale della struttura di microscopia prima dell'imaging e utilizzare un calcolatore di olio ad immersione per selezionare l'olio ad immersione adatto al campione.
Una volta che i campioni sono pronti, assicurarsi che i coperchi siano puliti e privi di residui pulendoli con una punta di cotone imbevuta di acqua o etanolo. Posizionare il campione in un microscopio 3D-SIM e trovare la cella per catturare l'immagine. Regolare la potenza delle linee laser pertinenti.
E i tempi di esposizione per massimizzare il rapporto segnale/rumore senza sbiancare significativamente il campione. Impostate i limiti superiore e inferiore del campione nella dimensione Z e procedete all'acquisizione di una pila. Eseguire l'algoritmo di ricostruzione sullo stack per ottenere una ricostruzione super risolta.
Controllare le ricostruzioni per gli artefatti noti e, se necessario, regolare i parametri per correggerli. Confronta la ricostruzione della SIM con un'immagine a campo largo per osservare i miglioramenti della risoluzione. Quando si esegue la microscopia a illuminazione strutturata multicolore, utilizzare l'algoritmo di allineamento per allineare correttamente i diversi canali, una volta pronta una ricostruzione soddisfacente.
Gli anelli di actina nello scheletro periodico della membrana hanno un aspetto periodico distintivo. Crea un'immagine di proiezione di massima intensità nel software di analisi delle immagini utilizzando tutti i piani focali in cui sono visibili gli anelli di actina. Nell'immagine di proiezione di massima intensità, disegna una linea perpendicolare attraverso anelli adiacenti visibili e registra l'intensità di fluorescenza insieme alla funzione del profilo di grafico delle linee del software.
Per calcolare la distanza media tra i picchi, annotare i massimi locali nel profilo della linea e misurare la distanza tra i singoli picchi di intensità fluorescente adiacenti. Per valutare la colocalizzazione di diverse proteine con anelli di actina nello scheletro periodico della membrana, eseguire una procedura di analisi di colocalizzazione sulle ricostruzioni SIM dell'actina e della proteina candidata. Disegna manualmente una selezione per definire il segmento iniziale dell'assone come regione di interesse, per il plug-in di colocalizzazione facile nella piattaforma software ed esegui l'analisi per calcolare il coefficiente di correlazione di Pearson per la colocalizzazione.
Durante l'analisi delle immagini SIM, le ricostruzioni delle pile di immagini, hanno mostrato una chiara periodicità degli anelli di actina. Un anticorpo anti anchirina G è stato utilizzato per visualizzare l'anchirina G.La colocalizzazione degli anelli di anchirina G e actina è stata testata nel segmento iniziale dell'assone utilizzando una procedura di analisi della colocalizzazione per calcolare il coefficiente di correlazione di Pearson. Il coefficiente di correlazione di Pearson per la colocalizzazione della fluorescenza degli anelli di anchirina G e actina era 0,36 più o meno 0,03.
È essenziale utilizzare l'olio di immersione giusto e regolare la potenza del laser e il tempo di esposizione per rendere visibili le linee della griglia. Una volta determinato che la proteina fa parte dello scheletro periodico della membrana, la sua funzione può essere studiata e stabilita nel mantenimento dello scheletro periodico della membrana. Ad esempio, è possibile analizzare gli effetti dell'abbattimento della proteina sugli anelli di actina.
Lo sviluppo di tecniche di microscopia a super risoluzione è la ragione per cui sappiamo che il segmento iniziale dell'assone contiene scheletro periodico di membrana composto da anelli di actina, spettro e anchirina. SIM ha permesso ai ricercatori di visualizzare facilmente i componenti periodici dello scheletro della membrana e di osservare gli anelli di actina nelle cellule vive.
