Ce protocole permet de résoudre le squelette périodique de la membrane dans le segment initial axonal des neurones cultivés. En examinant la localisation des protéines, il est possible d’obtenir des informations sur la fonction du squelette périodique de la membrane. Le principal avantage de cette technique est sa robustesse et sa facilité d’utilisation.
La microscopie à éclairage structuré est capable de résoudre le squelette périodique de la membrane et la préparation de l’échantillon est facile et directe. Toute personne ayant une expérience antérieure en microscopie à fluorescence peut facilement mettre en œuvre cette technique. Ce protocole est conçu pour maximiser le rapport signal/bruit lors de la préparation et de l’imagerie des échantillons.
Pour commencer, fixez les neurones en utilisant 4% de paraformaldéhyde pendant 12 minutes à température ambiante. Laver le couvercle une fois dans une solution tampon de phosphate à 0,2% BSA et incuber pendant 10 minutes dans une solution à 1% de Triton X dans PBS à température ambiante. Laver le couvercle avec du BSA dans une solution tampon de phosphate, diluer les anticorps anti-ankyrine G à l’aide de BSA dans une solution tampon de phosphate à un rapport de un à 200.
Ajouter la solution d’anticorps au couvercle et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Laver les cellules une fois dans une solution tampon de phosphate de BSA une fois dans 0,1% triton X dans une solution tampon de phosphate et une fois dans une solution tampon de phosphate. Diluer Fluoro 4 marqué, ajouter plus d’anticorps secondaires dans la solution tampon de phosphate BSA et ajouter au bordereau de couverture.
Laver les cellules une fois dans une solution tampon de phosphate BSA une fois dans 0,1% Triton X dans une solution tampon de phosphate, puis une fois dans une solution tampon de phosphate. Préparez une solution micromolaire de ferodine marquée dans une solution tampon de phosphate et ajoutez-la aux cellules. Laver les cellules une fois dans une solution tampon de phosphate d’albumine sérique bovine une fois dans 0,1% triton X dans une solution tampon de phosphate, puis une fois dans une solution tampon de phosphate.
Pour monter le couvercle sur une glissière en verre, appliquez une goutte de support de montage sur une glissière, trempez le couvercle dans de l’eau désionisée et tapotez-le avec une serviette en papier souple pour éliminer l’excès d’eau. Placez le couvercle sur la lame de verre et incubez à température ambiante pendant 24 heures. Si possible, consultez le personnel de l’installation de microscopie avant l’imagerie et utilisez un calculateur d’huile d’immersion pour sélectionner l’huile d’immersion appropriée pour l’échantillon.
Une fois les échantillons prêts, assurez-vous que les couvercles sont propres et exempts de tout résidu en les nettoyant avec une pointe de coton trempée dans de l’eau ou de l’éthanol. Placez l’échantillon dans un microscope 3D-SIM et trouvez la cellule pour capturer l’image. Ajustez la puissance des lignes laser concernées.
Et les temps d’exposition pour maximiser le rapport signal / bruit sans blanchir de manière significative l’échantillon. Définissez les limites supérieure et inférieure de l’échantillon dans la dimension Z et procédez à l’acquisition d’une pile. Exécutez l’algorithme de reconstruction sur la pile pour obtenir une reconstruction super résolue.
Vérifiez les reconstructions pour les artefacts connus et, si nécessaire, ajustez les paramètres pour les corriger. Comparez la reconstruction de la carte SIM à une image grand champ pour observer des améliorations de résolution. Lorsque vous effectuez une microscopie à éclairage structuré multicolore, utilisez l’algorithme d’alignement pour aligner correctement les différents canaux, une fois qu’une reconstruction satisfaisante est prête.
Les anneaux d’actine dans le squelette périodique de la membrane ont un aspect périodique distinctif. Créez une image de projection d’intensité maximale dans un logiciel d’analyse d’images en utilisant tous les plans focaux où les anneaux d’actine sont visibles. Sur l’image de projection d’intensité maximale, tracez une ligne perpendiculaire à travers les anneaux adjacents visibles et enregistrez l’intensité de fluorescence ainsi que la fonction de profil de tracé de ligne du logiciel.
Pour calculer la distance moyenne entre les pics, notez les maxima locaux dans le profil de ligne et mesurez la distance entre les pics d’intensité fluorescente adjacents individuels. Pour évaluer la colocalisation de différentes protéines avec des anneaux d’actine dans le squelette périodique de la membrane, exécutez une procédure d’analyse de colocalisation sur les reconstructions SIM de l’actine et de la protéine candidate. Dessinez manuellement une sélection pour définir le segment initial de l’axone comme une région d’intérêt, pour le plugin de colocalisation facile dans la plate-forme logicielle, et exécutez l’analyse pour calculer le coefficient de corrélation de Pearson pour la colocalisation.
Au cours de l’analyse d’images SIM, les reconstructions de piles d’images ont montré une périodicité claire des anneaux d’actine. Un anticorps anti-ankyrine G a été utilisé pour visualiser l’ankyrine G.La colocalisation des anneaux d’ankyrine G et d’actine a été testée dans le segment initial de l’axone à l’aide d’une procédure d’analyse de colocalisation pour calculer le coefficient de corrélation de Pearson. Le coefficient de corrélation de Pearson pour la colocalisation de la fluorescence de l’ankyrine G et des anneaux d’actine était de 0,36 plus ou moins 0,03.
Il est essentiel d’utiliser la bonne huile d’immersion et d’ajuster la puissance laser et le temps d’exposition pour rendre les lignes de la grille visibles. Une fois qu’il est déterminé que la protéine fait partie du squelette périodique de la membrane, sa fonction peut être étudiée et établie dans le maintien du squelette périodique de la membrane. Par exemple, les effets de l’élimination de la protéine sur les anneaux d’actine peuvent être analysés.
Le développement de techniques de microscopie à super résolution est la raison pour laquelle nous savons que le segment initial de l’axone contient un squelette périodique membranaire composé d’anneaux d’actine, de spectre et d’ankyrine. SIM a permis aux chercheurs de visualiser facilement les composants périodiques du squelette membranaire et d’examiner les anneaux d’actine dans les cellules vivantes.
